細胞焦亡與感染性疾病研究進展

游宇來，王 濤 綜述，龔建平△ 審校

(1.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院肝膽外科 402260；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶 400010)

細胞死亡是機體清除內(nèi)源性和外源性傷害刺激的重要機制，是機體免疫應(yīng)答的重要組成部分。隨著研究的深入，壞死、凋亡、脹亡、自噬、焦亡等細胞死亡方式逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。細胞焦亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞程序性死亡方式，由半胱氨酸蛋白酶(caspase)介導(dǎo)，細胞溶解性死亡伴炎性因子釋放，誘發(fā)聯(lián)級放大的炎性反應(yīng)。通過對細胞焦亡形態(tài)學(xué)特征、分子機制及其與感染性疾病關(guān)系的進一步研究，有助于加深對細胞死亡方式的認識，為疾病的防治提供新方向。本文就細胞焦亡與感染性疾病的研究進展綜述如下。

1 細胞焦亡的形態(tài)學(xué)特點

細胞焦亡和細胞凋亡一樣同樣具有核固縮、DNA斷裂和末端標(biāo)記測定法染色陽性的特征。但是在發(fā)生細胞焦亡時，活化的gasdermin D(GSDMD)具有打孔效應(yīng)，能穿透細胞膜，形成1～2 nm的GSDMD孔，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性及膜內(nèi)外的離子平衡性，水分內(nèi)流，細胞腫脹繼而發(fā)生細胞膜破裂，細胞發(fā)生滲透性裂解。由于這一過程中發(fā)生了細胞膜破裂，細胞內(nèi)容物大量滲出，包括白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-18，募集更多的炎癥細胞，引起并擴大周圍組織炎癥[1-2]。

2 細胞焦亡的分子機制

caspase家族根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能不同可分為兩類，第1類是與細胞凋亡相關(guān)的炎性因子，包括caspase-2、caspase-3、caspase-6、caspase-7、caspase-8、caspase-9、caspase-10在內(nèi)的凋亡因子，其中caspase-3為凋亡的主要調(diào)控因子，能被其他caspase激活，誘發(fā)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA降解，導(dǎo)致細胞死亡。另一類是主要與細胞焦亡相關(guān)的炎性因子，包括caspase-1、caspase-4、caspase-5、caspase-11、caspase-12、caspase-13和caspase-14[3]。存在于小鼠體內(nèi)的炎性caspase主要為caspase-1和caspase-11，而存在于人體內(nèi)的炎性caspase主要包括caspase-1、caspase-4和caspase-5[4]。人和小鼠體內(nèi)存在經(jīng)典和非經(jīng)典細胞焦亡途徑，分別在接受不同的刺激時經(jīng)不同通路啟動細胞焦亡。

2.1經(jīng)典細胞焦亡途徑 經(jīng)典細胞焦亡途徑描述的是以caspase-1激活為中心環(huán)節(jié)的一條通路。caspase-1的激活是由一種多蛋白復(fù)合的炎性小體介導(dǎo)的，炎性小體是一種由包括寡聚結(jié)構(gòu)域、富亮氨酸重復(fù)序列、熱蛋白結(jié)構(gòu)域(PYD)等結(jié)構(gòu)蛋白、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和caspase-1前體所構(gòu)成的多蛋白復(fù)合物[5]。NOD樣受體(NLRs)包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRC5，在炎性反應(yīng)和維持中起重要作用[6]。有研究用NLRP3A350V小鼠這一NLRP3高表達模型進行炎癥相關(guān)試驗發(fā)現(xiàn)，NLRP3A350V小鼠與野生型小鼠比較，包括單核細胞、中性粒細胞等炎癥指標(biāo)均高于野生型小鼠[7]。NLRP3主要能感知應(yīng)答病毒雙鏈RNA、細菌毒素和內(nèi)源性損傷信號等刺激，與細菌感染和膿毒血癥的發(fā)生有密切關(guān)系。在刺激信號作用下，NLRs暴露出ASC上的caspase激活招募結(jié)構(gòu)域(CARD)和PYD，通過CARD-CARD或PYD-PYD同型相互作用，將無活性的caspase-1二聚體裂解為具有活性的caspase-1，作用于IL-1β和IL-18前體并使其裂解為活性IL-1β和IL-18[8]，導(dǎo)致細胞焦亡發(fā)生。也有研究發(fā)現(xiàn)，NLRP1和NLRC4可在不依賴ASC的情況下與caspase-1前體直接結(jié)合發(fā)揮使其裂解[9]。在細菌感染性疾病中，細菌細胞壁成分脂多糖(LPS)通過Toll樣受體4/髓樣分化蛋白/分子標(biāo)記受體復(fù)合體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或在細菌的外膜囊泡介導(dǎo)下進入細胞質(zhì)，被炎性小體所識別，啟動細胞焦亡[10]。

在2015年一項突破性進展中，SHI等[11]找到了一個所有炎性caspase共同的作用底物蛋白GSDMD，活化的caspase通過切割GSDMD釋放其活性N端而引起細胞焦亡。KUANG等[12]通過X-光晶體衍射法解析了GSDMD-C的三維結(jié)構(gòu)，并結(jié)合X射線小角衍射、動態(tài)光散射等技術(shù)分析GSDMD結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)。GSDMD-C對維持GSDMD的穩(wěn)定有很大作用，且發(fā)現(xiàn)在與C端結(jié)構(gòu)域分開后，GSDMD-N端暴露出結(jié)構(gòu)域，進一步引起細胞焦亡。說明GSDMD-C端結(jié)構(gòu)域具有自我抑制和自我穩(wěn)定功能，GSDMD在活化caspase切割作用下釋放其活性N端，參與到經(jīng)典焦亡通路中。此前，DING等[13]曾證實，在真核細胞焦亡過程中，GSDMD的活性N端會轉(zhuǎn)移到細胞膜上，高效特異地破壞含有磷酸化磷脂酰肌醇或心磷脂的脂質(zhì)體，從細胞內(nèi)部破壞細胞膜，形成孔洞。說明活化的caspase-1切割GSDMD釋放出活性N端，在細胞膜上造孔，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)完整性和離子平衡性，使細胞發(fā)生滲透性裂解。

SHI等[11]通過CRISPR/CAS9全基因技術(shù)獲得了GSDMD缺陷小鼠，并發(fā)現(xiàn)在這種GSDMD缺陷小鼠身上有NLRP3、NRPC4和干擾素誘導(dǎo)蛋白2(AIM2)炎性小體所介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡通路均無法進行。同時，還有研究證實，Pyrin炎性小體所介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡通路同樣無法在GSDMD缺陷小鼠內(nèi)進行[14]。由此可以得出，在由NLRP3、NLRC4、AIM2和Pyrin等炎性小體介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡通路中，GSDMD蛋白發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，是焦亡通路中重要組成部分。KAYAGAKI等[15]用三磷酸腺苷(ATP)和鞭毛蛋白分別刺激GSDMD缺陷小鼠骨髓巨噬細胞和相應(yīng)野生型小鼠的骨髓巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)GSDMD缺陷組中8 h內(nèi)啟動焦亡的巨噬細胞數(shù)明顯少于野生組，但8～16 h內(nèi)兩組細胞死亡數(shù)無明顯差別。說明GSDMD雖然參與到經(jīng)典焦亡通路中，但可能并不是該通路中的必須分子，或者經(jīng)典焦亡通路存在多條通路，而GSDMD參與的僅是其中的1條或幾條。因此，經(jīng)典焦亡途徑中的關(guān)鍵分子及是否有尚未發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典焦亡通路等問題仍待研究。

2.2非經(jīng)典細胞焦亡途徑 除了經(jīng)典細胞焦亡途徑，人們逐漸發(fā)現(xiàn)caspase-4、caspase-5、caspase-11也可與LPS直接結(jié)合啟動焦亡進程，這種依賴于caspase-4、caspase-5、caspase-11的細胞死亡方式稱為為非經(jīng)典焦亡途徑。KAYAGAKI等[16]發(fā)現(xiàn)，caspase-1同樣參與到由LPS啟動的依賴caspase-11非經(jīng)典焦亡中，活化的caspase-1將無活性的IL-1β前體裂解為具有活性的IL-1β，且不同于caspase-1的是，caspase-11的活化并不依賴NLRP3和ASC，非經(jīng)典焦亡途徑開始進入人們的視線。

隨著對caspase-11介導(dǎo)的非經(jīng)典焦亡途徑的研究，SHI等[11]在使用GSDMD缺陷小鼠骨髓巨噬細胞炎癥GSDMD的作用時發(fā)現(xiàn)，GSDMD缺陷小鼠巨噬細胞在接受LPS刺激后，caspase-1活性和IL-1β分泌受到抑制，但是IL-1β的成熟卻不受抑制，表明在依賴caspase-11的非經(jīng)典細胞焦亡途徑中，GSDMD與caspase-1活化和IL-1β分泌相關(guān)，與IL-1β成熟無關(guān)。進一步研究顯示，GSDMD還參與了caspase-4和caspase-5介導(dǎo)的細胞焦亡，且主要作用機制與經(jīng)典焦亡途徑大致相同，均由GSDMD活性N端誘導(dǎo)細胞死亡。

2015年，YANG等[17]發(fā)現(xiàn)，在caspase-11介導(dǎo)的細胞焦亡過程中，裂解的泛連接蛋白1釋放ATP，能激活其敏感受體嘌呤能離子通道型受體7(P2X7)。P2X7在ATP反復(fù)刺激下，開放離子通道促進鉀離子外流和鈉、鈣離子內(nèi)流，形成非選擇性孔道，誘導(dǎo)細胞焦亡。有研究表明，Pannexin-1可能通過開放鉀離子通道來激活NLRP3，介導(dǎo)caspase-1活化和IL-1β釋放[18]。

3 細胞焦亡與感染性疾病研究進展

3.1細胞焦亡與細菌感染性疾病 細胞焦亡是一種機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一，是機體拮抗和清除細菌感染的重要防御機制。迄今為止，已經(jīng)證實弗氏志賀桿菌、沙門桿菌、李斯特桿菌、綠膿桿菌、嗜肺性軍團桿菌、耶爾森桿菌等均可誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生細胞焦亡。在感染過程中，細胞焦亡誘導(dǎo)宿主細胞死亡，有利于機體清除致病微生物，限制細菌生長繁殖，有效保護宿主自身。但是細胞焦亡對機體也有有害的一面，細胞焦亡在導(dǎo)致細胞死亡的同時激發(fā)炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)IL-1β和IL-18釋放，招募更多的炎癥細胞，是發(fā)生膿毒血癥的病理基礎(chǔ)。

caspase-4 、caspase-5、 caspase-11是細菌LPS的胞內(nèi)受體，其半胱天冬酶招募結(jié)構(gòu)域能直接與細菌LPS結(jié)合引起caspase發(fā)生寡聚而活化，介導(dǎo)細胞焦亡，是革蘭陰性菌誘導(dǎo)敗血癥的關(guān)鍵因素[11]。LIU等[19]通過試驗證實，在細菌入侵細胞時，炎性小體激活，介導(dǎo)細胞焦亡破裂，釋放出細菌和炎性介質(zhì)，達到清除細菌和釋放炎性介質(zhì)，以敲響免疫警報的作用。但是這種作用存在一種平衡，如果炎性介質(zhì)釋放過多，免疫警報過于強大，將募集大量的炎性細胞，擴大炎癥范圍和劇烈程度，引起敗血癥發(fā)生，導(dǎo)致致命性血管和器官損傷，可通過找出感染和機體免疫反應(yīng)的平衡點來治療敗血癥。GSDMD活性N端在殺傷感染的宿主細胞的同時并未傷及附近未被感染的細胞，且GSDMD活性N端能快速殺死培養(yǎng)皿中的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌。GSDMD具有能直接殺死細胞外細菌且不傷及未被感染細胞的特性，并提出了一種通過注射GSDMD活性N端來治療涉及抗生素耐藥菌的局部感染和難以控制的敗血癥的新思路。

在脾臟中，細胞焦亡是清除細菌感染的主要機制，通過焦亡途徑使病原體被釋放到細胞外，被吞噬細胞清除。但是在肝臟中，由IL-18介導(dǎo)的自然殺傷細胞(NK)也參與到病原體的清除過程中。之前的研究證實，適應(yīng)細胞內(nèi)生活方式的細菌可通過分泌抑制分子或改變其LPS結(jié)構(gòu)來逃避炎性小體監(jiān)測。近期研究證實，在青紫色素桿菌感染情況下，NK能通過其依賴穿孔素的細胞毒性來消除受感染肝細胞中細菌的復(fù)制功能，外源性IL-18能恢復(fù)NK對具有逃避炎性小體識別的李斯特菌的細胞毒性，說明炎性小體介導(dǎo)的細胞焦亡通路與NK的細胞毒性存在互補環(huán)節(jié)，能重新識別具有逃避炎性小體識別功能的病原體，為治療具有逃避炎性小體識別的特性病原體感染提供了理論依據(jù)，有助于開發(fā)新的藥物和新的治療模式[20]。

有研究顯示，用LPS刺激NLRP3過表達(NLRP3A350V)小鼠后，IL-17缺陷NLRP3過表達小鼠(NLRP3A350VIL-17-/-)中性粒細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)等較單純NLRP3過表達小鼠明顯降低，腫瘤壞死因子(TNF)缺陷小鼠(NLRP3A350VTNF-/-)較單純NLRP3過表達小鼠有輕微降低，3組小鼠的肝纖維化程度也符合該趨勢[7]。此研究提出可應(yīng)用抗IL-17或TNF藥物，如pentoxifylline和etanercept作為在由NRLP3介導(dǎo)的炎癥治療過程中預(yù)防炎癥擴散和肝纖維化的預(yù)防性治療，為感染性肝炎進展和肝纖維化形成提供預(yù)防措施。

3.2細胞焦亡與病毒感染性疾病 肝炎病毒感染可導(dǎo)致急性肝衰竭。D-半乳糖胺(D-Gal)是一種肝細胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，可造成肝彌漫性壞死和炎癥，與臨床病毒性肝炎的肝臟病理變化相似，大劑量可造成暴發(fā)型肝衰竭。WANG等[21]用D-Gal誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭，構(gòu)建病毒性肝炎致急性肝衰竭模型，分別注射外源性重組小鼠IL-10、ShIL-RNA和NLRP3抑制劑MCC950，結(jié)果顯示，IL-10組和MCC950組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、NH3和炎性細胞因子明顯降低，說明IL-10和NLRP3抑制劑MCC950逆轉(zhuǎn)了病毒性肝炎引起的急性肝衰竭，抑制了細胞焦亡，為病毒性肝炎急性肝衰竭的治療提供了新思路。

免疫缺陷病毒選擇性地侵犯帶有CD4分子的細胞，如T4淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等，致使宿主免疫系統(tǒng)癱瘓。人們通常將人類免疫缺陷病毒(HIV)感染過程中CD4+T細胞的死亡歸因于凋亡。DOITSH等[22]對感染了HIV-1的人脾臟和扁桃體組織進行檢測，結(jié)果表明，大多數(shù)死亡的CD4+T細胞并未受到感染，且這些細胞中caspase-1表達、IL-1β和IL-18分泌均明顯增加，說明由HIV感染引起的淋巴組織中大約95%的CD4+T細胞的死亡是由caspase-1介導(dǎo)的細胞焦亡引起的。而且不同于細菌感染中通過釋放炎癥信號募集更多免疫細胞來達到清除病原體的目的，HIV感染通過細胞焦亡釋放的炎癥信號吸引了更多的細胞進入感染組織發(fā)生焦亡，由此形成一個惡性循環(huán)，最終對免疫系統(tǒng)造成嚴重損害。使用caspase-3或caspase-6抑制劑或相互作用蛋白激酶受體抑制劑并不能阻止CD4+T細胞減少，而使用caspase-1抑制劑可阻止由HIV-1誘導(dǎo)的CD4+T細胞焦亡。針對抑制HIV對宿主免疫系統(tǒng)破壞性，MONROE等[23]運用DNA親和層析技術(shù)檢測CD4+T細胞中的HIV DNA片段，發(fā)現(xiàn)在敲除干擾素誘導(dǎo)核蛋白-16(IFI-16)基因后，IFI-16蛋白缺陷的CD4+T細胞的焦亡過程受到抑制，說明IFI-16蛋白功能與HIV感染誘導(dǎo)大量CD4+T細胞發(fā)生焦亡有關(guān)。胞內(nèi)IFI-16作為胞內(nèi)DNA感受器如何識別外來DNA和自身DNA，可能與其“開關(guān)模式”有關(guān)，當(dāng)IFI-16識別錯誤時，可介導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)攻擊健康細胞，從而引發(fā)嚴重的自身免疫性疾病[24]。以上3項研究揭示了HIV感染過程中絕大多數(shù)CD4+T細胞死亡的分子機制，為艾滋病的治療帶來了希望。

4 結(jié) 語

細胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的程序性細胞溶解，其經(jīng)典焦亡途徑依賴caspase-1，非經(jīng)典焦亡途徑依賴caspase-4、caspase-5、caspase-11。GSDMD和pannexin-1可能是細胞焦亡過程中的關(guān)鍵分子，但除二者之外，是否存在其他的關(guān)鍵分子及細胞焦亡的具體機制仍需進一步研究。細胞焦亡是機體對抗感染的重要機制，充分深入了解細胞焦亡在感染性疾病中的角色和作用，有助于解決臨床感染難題。細胞焦亡廣泛參與到動脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如阿爾茲海默癥和帕金森、呼吸系統(tǒng)急性損傷[25]、缺血再灌注損傷和腫瘤疾病[26])中，且發(fā)揮重要作用。相信對細胞焦亡的深入探索，能為相關(guān)臨床疾病的防治開辟新路徑。