斑馬魚模型用于藥物抗腫瘤活性篩選的研究進展

徐 碩，姜文清，鄺詠梅，徐文峰，金鵬飛

(北京醫(yī)院藥學部，國家老年醫(yī)學中心，藥物臨床風險與個體化應用評價北京市重點實驗室，北京 100730)

斑馬魚(zebrafish)又名藍條魚、花條魚和斑馬擔尼魚等，是一種熱帶觀賞魚，體長4～6 cm，屬鯉科短擔尼爾屬，原產于印度、孟加拉。自1994年冷泉港集會以及Nature和Science等雜志發(fā)表專題評述，到2009年斑馬魚全基因組測序完成，斑馬魚已成為一種公認的新型模式生物。

與線蟲、果蠅和鼠等其他模式生物相比，斑馬魚與人的器官在結構、生理和分子水平等方面相似性極高，和人類的基因組保守性很高，在蛋白質水平上，關鍵部位的同源性幾乎是100%。國內外利用斑馬魚及其突變體已建立了多種人類疾病模型[1-3]，并開展了相關的藥物篩選評價研究工作。

從腫瘤生物學角度來看，斑馬魚和人的腫瘤在組織學上非常相似；兩者腫瘤均具有遺傳性；人和斑馬魚的基因序列相比較，二者在細胞周期基因、腫瘤抑制基因和癌基因等方面均具有保守性。斑馬魚的胚胎特征與腫瘤相似，具有細胞分裂速度快、細胞凋亡速度延緩和血管生成能力旺盛等特點。本文對近年來斑馬魚模型在抗腫瘤活性篩選中的應用研究進行綜述。

1 抗腫瘤活性研究中斑馬魚模型的類型

1.1化學誘導致癌模型 Beckwith L G等[4]通過利用乙基亞硝基脲(ENU)處理，致使斑馬魚患皮膚癌，在大于1 mm的腫瘤里可觀察到血管新生。Lam S H等[5]對人及斑馬魚肝臟腫瘤的 microarray數(shù)據(jù)進行比較，發(fā)現(xiàn)導致癌癥發(fā)生的基因是保守的。常用致癌物亞硝基胍(MNNG)和9，10-二甲基-1，2-苯并蒽(DMBA)易導致斑馬魚胚胎腫瘤的發(fā)生[5-7]。

1.2基因突變模型 相比于野生型斑馬魚，抑癌基因失活的斑馬魚腫瘤發(fā)病率較高。Tp53是十分重要的抑癌基因，50%以上的腫瘤患者體內會發(fā)生該基因的突變[8]。Berghmans S等[9]利用靶向選擇性突變技術，建立了一個在Tp53的DNA結合結構域存在錯配突變的斑馬魚突變體。純合的Tp53突變體在8.5個月出現(xiàn)神經鞘腫瘤，另一個腫瘤抑制基因是結腸腺瘤息肉基因(APC)，為Wnt通路的重要組分[10]。因為APC發(fā)生突變常導致結腸腫瘤患者的Wnt通路被異常激活。Hurlstone A F L等[11]在篩選ENU突變的斑馬魚時發(fā)現(xiàn)了一個APC突變體，受精后96 h，純合的APC突變體死亡。雜合的APC突變體在胚胎期發(fā)育正常，但15個月后，腸道、肝臟和胰腺腫瘤發(fā)生于大多數(shù)胚胎[12]，并伴有高表達Wnt靶基因以及β-catenin 的累積，這些特征與人結腸腫瘤具有一致性。

1.3基因組改造模型 特定基因的活性上調而導致的腫瘤很適合采用轉基因斑馬魚進行研究。通過構建由斑馬魚rag2啟動子驅動小鼠c-myc與GFP的融合基因(zRag2-EGFP-mMyc)，或是單獨的小鼠c-myc基因(zRag2-mMyc)的轉基因品系，能使人T淋巴細胞白血病(T-ALL)的發(fā)病過程得到模擬[13]。zRag2-EGFP-mMyc的平均潛伏期是52 d。zRag2-mMyc 的平均潛伏期是44 d。在潛伏期之后，白血病由胸腺部位逐漸蔓延至腮弓、眼球后軟組織、骨骼肌及腹部組織。表達GFP的白血病細胞在移植后，依然能導致接受過放射的斑馬魚患上T-ALL。對該T-ALL模型做進一步改造，利用Cre-loxp系統(tǒng)使c-myc的表達得到控制[14]。

1.4移植模型 采用腫瘤細胞移植的方法能夠建立某些腫瘤的斑馬魚模型。崔戈等[15]分別構建BAMBI過表達穩(wěn)轉結腸癌細胞株SW620(BAMBI+組)、空載體紅色熒光蛋白基因轉染結腸癌細胞株SW620(EV組)，分別顯微注射到受精后第2天轉基因斑馬魚Tg(Apo14∶GFP)胚胎卵黃囊，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，用ImageJ軟件測量轉移至斑馬魚肝臟內結腸癌細胞的紅色熒光表達強度。結果表明，相比于EV組，激光共聚焦熒光顯微觀察顯示BAMBI+組斑馬魚肝內結腸癌細胞紅色熒光表達量顯著增加；BAMBI+組斑馬魚肝轉移發(fā)生率也明顯增加。構建的基因修飾人結腸癌細胞移植斑馬魚致肝轉移模型，可較好地模擬活體狀態(tài)的結腸癌肝轉移；BAMBI基因能促進異種移植入斑馬魚的結腸癌細胞發(fā)生肝轉移。

劉軍秀等[16]利用線性化的紅色熒光質粒pcDNA3.0+DsRed轉染人宮頸癌SiHa 細胞，通過顯微注射法將穩(wěn)定表達紅色熒光的SiHa細胞移植入48 hpf(發(fā)育后時數(shù))的FLK轉基因斑馬魚胚胎內，建立了人宮頸癌斑馬魚模型。結果顯示注射不同數(shù)量人宮頸癌SiHa細胞能不同程度地影響斑馬魚卵，產生最佳促進血管新生作用的是注射50～100個細胞。注射Matrigel的對照組斑馬魚，在注射后的第1和第2天突出到腸下靜脈血管籃外到卵黃的垂直分枝平均血管數(shù)頻率分別為2.8%±1.4%和5.4%±2.2%。而注射SiHa細胞的斑馬魚新生血管數(shù)明顯高于對照組，在注射后第1和第2天突出到腸下靜脈血管籃外到卵黃的垂直分枝平均血管數(shù)頻率分別為8.0%±2.7%和27.4%±3.2%。

2 斑馬魚模型在抗腫瘤活性成分篩選中的應用

2.1在天然產物或中藥活性篩選中的應用 大量研究顯示，多種腫瘤(包括實體瘤和血液腫瘤)的生成、轉移、復發(fā)和預后都與腫瘤血管生成密切相關。夏小艷等[17]采用斑馬魚模型，測定靛玉紅的抑制血管生成活性。結果表明，質量濃度為10和50 mg·L-1可明顯抑制斑馬魚胚胎體節(jié)間血管生成，抑制率為20.9%。

楊大松等[18]從土黨參(金錢豹Campanumoeajavanica的根)90%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位中分離得到14個化合物，采用斑馬魚胚胎模型對其抗血管生成活性進行評價。結果顯示，4E，8E，12E-三烯-10-炔-1，6，7-十四烷三醇(3)和9-(2-四氫吡喃)-8E-烯-4，6-二炔-3-壬醇(4)在質量濃度為50 μg·mL-1時對斑馬魚節(jié)間血流具有明顯的抑制作用，化合物3與4抗斑馬魚血管生成的EC50分別為136.38和68.70 μg·mL-1。

林風等[19]對海洋小單胞菌產生的縮肽類化合物rakicidins的體內外抗腫瘤活性進行了研究。結果顯示，Rakicidin B1、A和B對人結腸癌(HCT-8)細胞的增殖具有明顯的抑制作用，在乏氧培養(yǎng)條件下的抑制作用更強，與在常氧條件下相比，分別為各自的15，26和14倍。利用移植人結腸癌HCT-8腫瘤斑馬魚模型，測試了體內抗腫瘤活性，化合物B和B1可明顯抑制腫瘤生長。王榮春等[20]通過將SiHa細胞注入48 hpf的斑馬魚胚胎卵黃囊，建立斑馬魚移植瘤模型，采用細胞增殖實驗(MTT)測定蘆薈大黃素(AE)在不同質量濃度下對人宮頸癌細胞SiHa生長的抑制作用。結果表明，AE質量濃度為1.0和0.5 μg·mL-1時可抑制斑馬魚移植瘤的增殖和轉移，MTT法顯示，AE對SiHa細胞的生長具有明顯抑制作用，表現(xiàn)出一定的質量濃度-時間-效應依賴關系。

黃志軍等[21]在斑馬魚卵黃囊內植入熒光標記的人乳腺癌(MCF-7)細胞，建立了移植瘤模型，采用該模型探討小金膠囊(麝香、木鱉子、制草烏和楓香脂等10味中藥組成)的抗腫瘤作用，對新生血管形成的抑制作用的觀察是利用轉基因斑馬魚。結果顯示，小金膠囊在質量濃度為26.47，88.24和264.72 μg·mL-1時對斑馬魚MCF-7移植瘤的抑制率分別為31.66%，54.35%和53.77%，在質量濃度為264.72 μg·mL-1時可明顯抑制血管形成和誘導細胞凋亡，抑制率和誘導率分別是21.74% 和28.92%。

韓利文等[22]以TG(VEGFR2∶GFP)系血管熒光轉基因斑馬魚和AB系斑馬魚為模型，分別用單體成分靛玉紅、虎杖提取物、長春花提取物和西黃丸處理斑馬魚胚胎，考察對斑馬魚胚胎血管生成的影響。結果顯示，靛玉紅在質量濃度為50 μg·mL-1時能顯著抑制斑馬魚節(jié)間血管的生成；虎杖、長春花乙酸乙酯提取物分別在質量濃度為10和100 μg·mL-1對斑馬魚血管生成具有明顯抑制作用；西黃丸溶液質量濃度為100 μg·mL-1時抑制血管生成作用與對照組相比具有顯著差異。

2.2在化學藥物篩選中的應用 呂文文等[23]采用斑馬魚模型，考察了化合物的體內抗腫瘤血管生成活性。結果N-芐基-4，6-二甲氧基鄰苯二甲酰亞胺和N-芐基-4，6-二羥基鄰苯二甲酰亞胺可明顯抑制人肺腺癌A549細胞中血管內皮生長因子的分泌，并對斑馬魚體節(jié)間血管的生成有明顯抑制作用。

于歌等[24]用不同質量濃度鹽酸多西環(huán)素(Dox)對斑馬魚胚胎進行處理，誘導其肝臟異常增生，利用毒性作用及綜合評價誘導效應，用來確定適合的誘導質量濃度，對索拉非尼抑制肝部異常增生的能力進行研究。結果表明，Dox的最適誘導質量濃度是60 mg·L-1，索拉非尼能明顯抑制斑馬魚模型的肝部異常增生。

2.3在中西藥聯(lián)用抗腫瘤中的應用 薛迪等[25]采用的實驗模型為24 hpf(hour post fertilization，hpf)健康TG(VEGFR2∶GFP)系血管熒光轉基因斑馬魚，分別用復方苦參注射液、順鉑及其兩藥合用處理24 h，以節(jié)間血管作為檢測指標，用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。結果顯示，順鉑質量濃度為50和100 μg·mL-1時對節(jié)間血管有明顯的抑制作用，質量濃度為5 000 μg·mL-1的復方苦參注射液抑制節(jié)間血管作用明顯，兩藥合用時比單用具有更明顯的抑制效果。

3 討論

斑馬魚與人類基因組學的相似度達到87%，心血管、神經和代謝系統(tǒng)的解剖結構、生理、分子生理學特征與哺乳動物相似性高，是一種理想的動物模型，運用斑馬魚能進行大規(guī)模藥物篩選。該模型能避免細胞和化學篩選模型的局限性，從整體水平直觀地評估藥物的治療作用、不良反應和毒性作用等。有報道近期美國科學家成功培育出一種透明斑馬魚，人們能夠直視這種斑馬魚的內部器官，實時觀測活體器官中的腫瘤以及其他各類腫瘤的生長過程，這類新培育出的斑馬魚會在整個生命過程中保持透明狀態(tài)[26]。斑馬魚生物模式可作為一個系統(tǒng)的生物學應用于藥物開發(fā)，也可將斑馬魚發(fā)育毒理或實驗模型用于化合物的毒性篩選中[27-28]。

斑馬魚在新藥發(fā)現(xiàn)的應用有一定局限性，如目前仍缺少能夠重現(xiàn)人類疾病機制的斑馬魚模型。對于中藥藥效物質基礎的研究是發(fā)現(xiàn)新藥的重要途徑之一，通過對有效成分的結構改造，有可能發(fā)現(xiàn)更多高效低毒的先導化合物[29]。利用斑馬魚作為藥物篩選模型尚處于發(fā)展階段，但已顯示出巨大的潛力。相信在科學家們的共同努力下，斑馬魚模型在藥物抗腫瘤活性篩選中的應用研究會越來越深入，將發(fā)現(xiàn)更多新的活性化合物，對這些活性成分的研究也會不斷加深人們對生命現(xiàn)象的認識。

參考文獻：

[1] Langheinrich U.Zebrafish：a new model on the pharmaceutical catwalk[J].Bioessays，2003，25(9)：904-912.

[2] Cross L M，Cook M A，Lin S，et al.Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(5)：911-915.

[3] Liu S，Leach S D.Zebrafish models for cancer[J].Annu Rev Pathol，2011，(6)：71-93.

[4] Beckwith L G，Moore J L，Tsao-Wu G S，et al.Ethylnitrosourea induces neoplasia in zebrafish (Daniorerio) [J].Lab Invest，2000，80(3)：379-385.

[5] Lam S H，Wu Y L，Vega V B，et al.Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression[J].Nat Biotechnol，2006，24(1)：73-75.

[6] SpitsbergenJ M，Tsai H W，Reddy A，et al.Neoplasia in zebrafish (Daniorerio) treated withN-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine by three exposure routes at different developmental stages[J].Toxicol Pathol，2000，28(5)：716-725.

[7] Spitsbergen J M，Tsai H W，Reddy A，et al.Neoplasia in zebrafish (Daniorerio) treated with 7，12-dimethylbenz[a]anthracene by two exposure routes at different developmental stages[J].Toxicol Pathol，2000，28(5)：705-715.

[8] Beroud C，Soussi T.The UMD-p53 database：new mutations and analysis tools[J].Human Mutat，2003，21(3)：176-181.

[9] Berghmans S，Murphey R D，Wienholds E，et al.Tp53 mutant zebrafish develop malignant peripheral nerve sheath tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(2)：407-412.

[10]Logan C Y，Nusse R.The Wnt signaling pathway in development and disease[J].Annu Rev Cell Dev Biol，2004，(20):781-810.

[11]Hurlstone A F L，Haramis A P G，Wienholds E，et al.The Wnt/β-catenin pathway regulates cardiac valve formation[J].Nature，2003，425(6958)：633-637.

[12]Haramis A P，Hurlstone A，van der Velden Y，et al.Adenomatous polyposis coli-deficient zebrafish are susceptible to digestive tract neoplasia[J].EMBO Rep，2006，7(4)：444-449.

[13]Langenau D M，Traver D，F(xiàn)errando A A，et al.Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish[J].Science，2003，299(5608)：887-890.

[14]Langenau D M，F(xiàn)eng H，Berghmans S，et al.Cre/lox-regulated transgenic zebrafish model with conditional myc-induced T cell acute lymphoblastic leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(17)：6068-6073.

[15]崔戈，謝珊珊，張婷，等.BAMBI基因過表達人結腸癌細胞移植斑馬魚致肝轉移模型的構建[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2015，9(21)：3939-3945.

[16]劉軍秀，夏夢，何勉，等.宮頸癌細胞促進血管新生斑馬魚模型的建立[J].中山大學學報：醫(yī)學科學版，2015，36(3)：456-460.

[17]夏小艷，劉可春，王思鋒，等.大青葉中靛玉紅的抗血管生成活性研究[J].中國藥學雜志，2010，45(3)：187-189.

[18]楊大松，李資磊，王雪，等.土黨參的化學成分及其抗血管生成活性研究[J].中草藥，2015，46(4)：470-475.

[19]林風，陳曉明，周劍，等.海洋小單孢菌產生的縮肽類化合物rakicidins抗腫瘤活性研究[J].中國抗生素雜志，2016，41(7)：516-519，523.

[20]王榮春，韓利文，陳錫強，等.利用斑馬魚模型研究蘆薈大黃素對宮頸癌細胞SiHa的抑制作用[J].山東科學，2016，29(2)：14-18.

[21]黃志軍，蘭小紅，趙剛，等.小金膠囊對斑馬魚移植瘤的抗腫瘤作用[J].中成藥，2016，38(9)：1902-1906.

[22]韓利文，袁延強，何秋霞，等.斑馬魚模型在中藥活性篩選中的適用性研究[J].中草藥，2011，42(10)：2037-2041.

[23]呂文文，孫迎東，姜宏，等.新型N-取代鄰苯二甲酰亞胺類衍生物抗腫瘤血管生成活性評價[J].藥學研究，2016，35(10)：583-586.

[24]于歌，趙倩，劉云章，等.轉基因斑馬魚模型應用于索拉非尼抗肝癌活性篩選的方法研究[J].中國海洋藥物，2017，36(1)：48-54.

[25]薛迪，韓利文，何秋霞，等.復方苦參注射液聯(lián)合順鉑對斑馬魚血管生成的協(xié)同作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26(7)：1585-1587.

[26]謝菲，陳晗，李建明，等.斑馬魚在腫瘤研究中的應用[J].中國熱帶醫(yī)學，2009，9(6)：1161-1164.

[27]Mushtaq M Y，Verpoorte R，Kim H K.Zebrafish as a model for systems biology[J].Biotechnol Genet Eng Rev，2013，29(2)：187-205.

[28]Ball J S，Stedman D B，Hillegass J M，et al.Fishing for teratogens：a consortium effort for a harmonized zebrafish developmental toxicology assay[J].Toxicol Sci，2014，139(1)：210-219.

[29]姚佳慧，王義仁，周楠，等.Mcl-1小分子抑制劑在腫瘤治療中的應用進展[J].西北藥學雜志，2016，31(5)：547-552.