蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌的Ames試驗

丁麗軍， 奚照壽， 袁華根

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州 225300)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)又稱糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)，屬于D群鏈球菌，是人和動物腸道內(nèi)主要菌群之一[1]。糞腸球菌能產(chǎn)生細菌素等抑菌物質(zhì)，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長，改善腸道微環(huán)境[2]；還能抑制腸道內(nèi)產(chǎn)尿素酶細菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內(nèi)毒素的含量，使血液中氨和內(nèi)毒素的含量下降[3]。糞腸球菌作為一種益生菌，在醫(yī)學和食品工程領域得到廣泛應用[4-5]。糞腸球菌是我國農(nóng)業(yè)部2013年《飼料添加劑品種目錄》中公布的飼料級微生物添加劑菌種之一。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加糞腸球菌具有提高動物生產(chǎn)性能、改善營養(yǎng)物質(zhì)代謝和提高免疫功能等作用[6-9]。蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌是采用某種特殊蛋白對糞腸球菌進行修飾的產(chǎn)品，以期在給予此益生菌的同時能對免疫應答有所增強。本研究通過Ames試驗以評價其體外致突變性，可為該產(chǎn)品的安全性評價積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物、試驗動物及菌株 受試物為蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌粉，5×109CFU/g，批號20141206，由江蘇省某生物技術公司研制。

SD大鼠，體質(zhì)量200 g左右，購自揚州大學比較醫(yī)學中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2012-0004，使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0029。飼喂經(jīng)60Co照射飼料，(24±2) ℃，濕度(60±20)%，自由采食和飲水，飲水為符合城市飲用水標準的自來水。試驗前在試驗環(huán)境中適應3 d。

試驗菌株：鼠傷寒沙門氏菌突變株TA97、TA98、TA100和TA102，由江蘇省疾病控制中心提供，試驗前經(jīng)菌株鑒定符合要求。

1.1.2 試劑及配制 陽性對照物：2-氨基芴，純度>99%，日本東京化成工業(yè)株式會社；敵克松，純度98.8%，美國DIMA 技術有限公司；疊氮鈉，純度大于98%，美國Amresco公司；多氯聯(lián)苯(Aroclor1254)，美國Crescent Chemical有限公司。疊氮鈉溶解在水中，其他陽性對照物均用二甲基亞砜作為溶劑配制成相應濃度溶液。

0.5 mmol/L組氨酸-0.5 mmol/L生物素溶液、20%葡萄糖溶液、0.05 mol/L葡萄糖-6-磷酸溶液、營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、頂層及底層瓊脂培養(yǎng)基等，均按食品安全國家標準細菌回復突變試驗(GB 15193.4—2014)中規(guī)定配制。

大鼠肝S9的誘導和制備：采用多氯聯(lián)苯(Aroclor1254)作為誘導劑，多氯聯(lián)苯溶于玉米油中，濃度為200 mg/mL，按 500 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射SD大鼠，給予正常的飲食和飲水。誘導注射后5 d，脫頸椎處死。按GB 15193.4—2014方法制備S9及S9混合液。S9制成后經(jīng)無菌檢查、蛋白含量測定、生物活性鑒定合格后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 增菌培養(yǎng) 將保存的TA97、TA98、TA100、TA102菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃振蕩(100次/min)培養(yǎng) 10 h。該菌株培養(yǎng)物應1 mL不少于1×109～2×109活菌數(shù)。

1.2.2 平板摻入法Ames試驗 配制0.5～500.0 mg/mL受試物系列濃度水溶液。

取已融化并在45 ℃保溫的頂層培養(yǎng)基2.0 mL，依次加入受試物溶液0.1 mL(每皿分別含受試物0.05、0.50、5.00、50.00 mg)和試驗菌株增菌液0.1 mL(需活化時加10% S9混合液0.5 mL)，迅速混勻，倒在底層培養(yǎng)基上，平放固化，37 ℃ 培養(yǎng)48 h，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)及每處理各皿回變菌落數(shù)的平均數(shù)。

除受試物各劑量組外，還同時設陰性對照(滅菌水)、二甲基亞砜溶劑對照和陽性對照。陽性誘變劑為：-S9混合液時TA97、TA98、TA102菌株陽性對照物為敵克松，50.0 μg/皿；TA100菌陽性對照物為疊氮鈉NaN3，1.5 μg/皿。+S9混合液時TA97、TA98、TA100及TA102菌均以2-氨基芴為對照，10.0 μg/皿。每處理6個平皿，平行試驗2次。

1.2.3 結果判定 若受試樣品的回復突變菌落數(shù)等于或大于陰性對照組2倍，且有劑量-反應關系；或某一劑量超過陰性對照組2倍以上，呈現(xiàn)可重復的并有統(tǒng)計學意義時，即可認為受試物為誘變陽性。

2 結果與分析

Ames試驗結果，由表1可知，陽性對照組引起鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102這4 株試驗菌株的回復突變菌落數(shù)明顯增加，并遠超過陰性對照組的2倍以上；而受試品0.05、0.5、5.0、50.0 mg/皿的各劑量組，在加或不加S9活化時，回變菌落數(shù)均未超過陰性對照組菌落數(shù)的2倍，亦無劑量-反應關系。因此，受試品的Ames試驗結果為陰性。

表1 蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌的Ames試驗

3 結論與討論

蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌的Ames試驗結果為陰性，表明該產(chǎn)品對鼠傷寒沙門氏菌突變試驗菌株無致突變作用。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部新飼料或飼料添加劑安全性評價指南，致突變試驗除了Ames試驗外，還必須進行小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗。在這3個試驗的基礎上，根據(jù)試驗結果評估是否還需進行其他如顯性致死試驗等致突變試驗。本研究中受試物蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌的Ames試驗結果雖為陰性，至少還需進行小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗，才可對其致突變作用進行基本評價。