甲狀腺癌相關(guān)基因及其在臨床診斷中應用的研究進展

魏 佳，王瑤琪，孫 旭，逄仁柱，楊 帥，石 亮，李 勇，孟憲瑛

(吉林大學第一醫(yī)院甲狀腺外科，吉林 長春 130021)

甲狀腺癌是最常見的來源于內(nèi)分泌系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，近30年來其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升[1]。在各類甲狀腺癌中，甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見的分型，其次是甲狀腺濾泡狀癌(follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC)，來源于甲狀腺濾泡旁細胞(C細胞)的甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)較為少見，惡性程度高、預后差的未分化甲狀腺癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)最為少見?，F(xiàn)階段針對甲狀腺癌的診斷主要依靠頸部超聲及超聲引導下細針穿刺活檢(fine-needle aspiration biopsy，F(xiàn)NAB)[2]。隨著甲狀腺癌基因水平研究的日漸增多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，其為甲狀腺癌的早期診斷提供了一些新思路。學者們在從事甲狀腺癌相關(guān)基因的研究過程中不僅發(fā)現(xiàn)不同的基因突變或重排可能導致不同分型的甲狀腺惡性腫瘤，還發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基因的改變會影響腫瘤的侵襲性和預后等。研究者們對一些基因發(fā)生突變的原因也有了一些認識，但是甲狀腺癌病因?qū)W方面的研究尚不明確。目前國內(nèi)外針對甲狀腺癌相關(guān)基因的多項研究中已經(jīng)初步建立了甲狀腺癌在基因?qū)用娴脑缙谠\斷方法，明顯提高了甲狀腺惡性腫瘤的超早期診斷水平，并且能夠運用基因的相應特點指導臨床治療[3]。

1 甲狀腺癌相關(guān)基因

1.1 v-raf鼠類肉瘤濾過性病毒致癌基因同源體B1(BRAF)基因突變BRAF基因定位在7號染色體上，編碼BRAF激酶，在包括甲狀腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有BRAF基因突變。BRAF在RAS/RAF/絲蘇氨酸蛋白激酶(MEK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路中起到連接RAS和MEK的作用，RAS能夠結(jié)合并激活BRAF激酶，然后由BRAF磷酸化并激活MEK，進而激活ERK和絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的所有下游效應器分子，最終影響細胞的生長和增殖。這一連鎖反應與甲狀腺腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和復發(fā)有密切關(guān)聯(lián)[4]。BRAF基因突變在甲狀腺良性腫瘤和PTC中比較常見。絕大多數(shù)(61.7%)BRAF突變?yōu)锽RAF V600E位點發(fā)生堿基取代，BRAF V600E突變是PTC發(fā)展過程中的啟動基因，突變發(fā)生在BRAF基因第1 799位點上，表現(xiàn)為堿基T突變?yōu)锳，該位點也有其他突變發(fā)生，包括堿基T突變?yōu)镚或C，但是T到A的突變與PTC的發(fā)生最為密切[5]。該突變導致了氨基酸鏈的第600位密碼子處的纈氨酸被替換為谷氨酸，從而激活BRAF激酶使其出現(xiàn)致癌作用[6]。在PTC中，最常見的基因改變就是BRAF突變(36%～69%)，且在不同的地域和人種中均有分布[7-8]。有研究[9]表明：在PTC中47.8%的BRAF基因發(fā)生突變，BRAF V600E基因與腫瘤的中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲性有密切關(guān)聯(lián)，并且只有中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BRAF V600E突變有關(guān)，所以對BRAF V600E進行基因檢測有助于臨床醫(yī)生判斷術(shù)中是否需要預防性清掃頸部淋巴結(jié)。

1.2 轉(zhuǎn)染中重排(rearranged during transfection,RET)/PTC基因重排和RET基因突變RET基因位于人10號染色體的長臂11.2區(qū)，其編碼的膜受體酪氨酸激酶蛋白可以調(diào)節(jié)細胞的增殖、生長、分化、遷移和凋亡，該受體蛋白高度表達于濾泡旁細胞中。RET基因重排后與PTC的發(fā)生關(guān)系密切，故重排后稱為RET/PTC基因。RET/PTC重排后導致甲狀腺濾泡細胞中的受體酪氨酸激酶被激活而引起MAPK通路異常激活，使通路下游信號持續(xù)開放，導致細胞癌變[10]。最常見的RET重排是RET/PTC1和RET/PTC3，占全部突變的90%以上，并且RET/PTC1和RET/PTC3重排均來源于10號染色體的倒位[11]。RET/PTC重排在PTC中發(fā)生的頻率僅次于BRAF突變。RET基因重排與電離輻射、地區(qū)、年齡和性別等有關(guān)聯(lián)，在中國大陸人群中比較少見，RET/PTC3常見于兒童PTC且與電離輻射史有密切關(guān)聯(lián)[12]。

RET基因突變與MTC關(guān)系最為密切， MTC是來源于甲狀腺濾泡旁細胞的腫瘤。RET基因的多個外顯子均可發(fā)生突變，其中16號外顯子突變所占的比例最高[13]。另外，Romei等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)： RET基因在某些位點上的突變導致的MTC有遺傳因素的影響，在729例曾被分類為散發(fā)性MTC的病例中47例有家族遺傳史(6.5%)，由此可以預測約有20%～25%的MTC患者為家族遺傳性甲狀腺髓樣癌(familial medullary thyroid carcinoma，F(xiàn)MTC)。

1.3 RAS基因RAS致癌基因家族有3種不同的家族成員，分別是K-ras、H-ras和N-ras，分別定位在12、11和1號染色體上，在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程中調(diào)節(jié)2個重要的獨立通路，即MAPK通路和PI3K/Akt通路。這3種基因在甲狀腺癌中均有發(fā)生突變的現(xiàn)象，其中N-ras基因第61密碼子突變最常見，其次為第12位密碼子，然后是H-ras基因的突變[10]。RAS突變與BRAF突變表現(xiàn)出與組織學的緊密聯(lián)系，并且證實了MAPK通路的改變在甲狀腺癌的發(fā)生中起到重要的作用[15]。學者們在RAS基因第12和61位密碼子突變中發(fā)現(xiàn)了體細胞單核苷酸突變，并且發(fā)現(xiàn)RAS基因突變不僅發(fā)生于惡性腫瘤當中，也可能出現(xiàn)在增生的甲狀腺結(jié)節(jié)中，其突變概率在濾泡狀腺瘤中為20%～40%，PTC中約10%，F(xiàn)TC中為30% ～50%，ATC中約55%，而濾泡乳頭狀癌中為25% ～45%[16]。

1.4 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reserve transcriptase,TERT)基因TERT啟動子突變可改變端粒酶活性，端粒酶是存在于染色體末端的核蛋白復合物，涉及端粒的延伸，其DNA序列由幾個重復的堿基TTAGGG組成，其主要功能是保護染色體完整性和基因組穩(wěn)定性，因此，該突變在細胞的增殖和腫瘤的生成過程中起到十分重要的作用[9]。端粒復合物由不同的部分組成，其中最重要的是端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位、端粒酶的RNA組分和角化不良蛋白[17]。TERT啟動子突變在FTC和PTC中均有檢出，突變發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始位點上游-124 bp和-146 bp的2個位置，即突變-124G>A(chr5:1,295,228C>T)和突變-146G>A(chr5:1,295,250C>T)，通過在TERT啟動子區(qū)內(nèi)產(chǎn)生ETS轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)合位點(GGAA)而賦予TERT啟動子區(qū)增加活性的能力[18]。雖然TERT啟動子突變在PTC中罕見，并且克隆并不活躍，但其在晚期癌癥中經(jīng)?？梢员粰z出并且處于活躍的復制期[19]。TERT啟動子突變與甲狀腺癌惡性程度和預后有密切關(guān)聯(lián)，該種突變在具有高侵襲性的FTC和PTC中更為常見，且明確提示預后不良。如果該突變與BRAF突變、RAS突變等其他致癌突變等同時出現(xiàn)，則提示腫瘤的侵襲性高并且預后較差， 如TERT 啟動子突變-124G>A和BRAF V600E突變的共存會導致更差的預后[20]。TERT啟動子突變同時也是PTC患者死亡的重要指標；相反，無TERT突變預示著PTC患者有更長的生存期[21]。

1.5 p53基因研究[4]顯示：幾種腫瘤抑制基因(p53、Rb、p16和p21基因，分別編碼P53、Rb、P16和P21蛋白)的改變與甲狀腺癌發(fā)生有關(guān)，大部分的p53突變導致蛋白質(zhì)表達發(fā)生改變。其中最受關(guān)注的是位于17號染色體短臂上的p53基因，p53突變在多種人類癌癥中均有發(fā)生[22-23]。p53位于17號染色體的短臂(17q31)，編碼的P53蛋白的主要生物學作用是調(diào)控細胞周期中在G1期發(fā)生的DNA損傷，從而維持細胞正常生長，抑制細胞惡性增殖。突變后的p53基因無法完成這一過程，進而導致細胞的惡性轉(zhuǎn)化。各種侵襲性強的特殊PTC亞型、低分化型甲狀腺癌(poorly differentiated thyroid carcinoma，PDTC)和ATC中常可檢測出p53突變或者P53蛋白異常[24]。p53基因突變與甲狀腺惡性腫瘤的去分化有關(guān)聯(lián)，多提示預后不良[11]。Balta等[25]跟蹤調(diào)查了87例甲狀腺腫瘤患者(包括47例PTC和40例良性腫瘤)的預后情況，隨訪期長達10年，并對甲狀腺腫瘤患者進行了4種癌基因蛋白的檢測，結(jié)合病理學檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PTC患者細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和P53蛋白表達水平明顯增加，并且對于疾病的預后有著指示性作用；PCT患者bcl-2和C-erB-2蛋白表達水平雖然也明顯增加，但是其表達水平與疾病預后不良無明顯的相關(guān)性。CyclinD1和P53蛋白可作為指示PTC預后不良的指標。p53突變不存在于正常的甲狀腺組織或者良性病變中，包括甲狀腺濾泡腺瘤、慢性甲狀腺炎和甲狀腺囊腫[26]。p53突變或P53蛋白異?？捎糜谂袛囝A后并為靶向治療藥物提供靶點。

1.6 其他基因甲狀腺特異性轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活體 γ(PAX8-PPARγ)重排是第2、3 條染色體t(2；3)(q13；p25)基因易位的結(jié)果。PAX8/PPARγ基因重排廣泛存在于甲狀腺疾病中，常見于FTC中，也可見于少數(shù)PTC和濾泡狀腺瘤中，而且在年輕甲狀腺癌患者中常顯示出更高的陽性率，血管浸潤轉(zhuǎn)移率也相應增高[27]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)如MMP2和MMP9基因表達上調(diào)可導致PTC細胞侵襲性增強，在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用[28]。有研究[29]顯示：聯(lián)合檢測環(huán)氧化酶2(COX-2)和MMP9可以作為PTC術(shù)前診斷和判定有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一項有效生物學指標。其他基因包括缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、Wnt/β連環(huán)蛋白(β-catenin)、核因子κB(NF-κB)和EIF1AX等也與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展和預后有一定的關(guān)系[30-31]。此外，有學者在80例甲狀腺癌患者腫瘤組織中的57個表觀遺傳調(diào)控基因中發(fā)現(xiàn)了93個突變，且9個基因具有多突變，其中MLL(1.7%)、ARID1B(1.0%)和MLL3(1.0%)突變最常見，這些突變也許預示了甲狀腺癌相關(guān)基因未來的研究方向[32]。

2 甲狀腺癌的分子檢測和診斷意義

2.1 分子檢測方法臨床上現(xiàn)有的單基因突變檢測方法主要有以下幾種：①直接測序法，即Sanger測序，也稱之為第一代基因測序。利用雙脫氧鏈末端終止法，其基本原理為雙脫氧核苷三磷酸 (dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR延伸所需的3′-羥基，因此當DNA鏈加入分子ddNTP，延伸就此終止。模板、引物和4種含有不同的放射性同位素標記的核苷酸的ddNTP分別與DNA聚合酶混合形成長短不一的DNA片段，隨后進行聚丙烯酰胺變性凝膠電泳得到不同的放射性條帶，從而能夠讀取相應雙鏈DNA的序列。在臨床上應用時需要PCR儀、電泳儀和測序儀，可以直接讀取序列，明確突變類型，本方法也是基因突變檢測的金標準。缺點是對檢測條件、組織質(zhì)量和技術(shù)水平要求較高，并且耗時長(2～3 d)，敏感性不足(需要組織中突變體達到20%～30%)，且產(chǎn)物純化不可控[33]。②熒光定量PCR。該方法提取腫瘤組織DNA后，將樣本分別加入獨立的試管中并放入實時PCR儀，待反應完成后將突變與對照反應得到的反應曲線進行比較從而完成分析，應用Taqman探針的原理，利用帶有熒光標記的Taqman探針與突變基因的雜交反應來分析樣品。熒光定量PCR只能針對固定的已知突變進行檢測，具有耗時短、操作簡便、分析結(jié)果直觀和敏感性相對較高(可檢測有10%的突變率)等優(yōu)點。但是該方法需要精確的反應條件，優(yōu)化條件較為復雜。該方法可用于檢測KRAS基因突變和表皮生長因子受體(EGFR)基因突變等[34]。③突變阻滯擴增法(amplification refractory mutation system，ARMS)，即等位基因特異性PCR結(jié)合Taqman探針對突變基因進行檢測。原理為通過對突變DNA模板設(shè)計突變正向引物使突變DNA成功延伸，與Taqman探針結(jié)合后發(fā)出熒光信號達到檢測目的。而野生型DNA則無法與突變正向引物相結(jié)合，從而無法延伸，不能發(fā)出熒光信號，使用實時PCR儀可以完成這一過程。該方法在熒光定量PCR的基礎(chǔ)上設(shè)計相應引物，可以對樣本進行富集，提高靈敏度(可檢測1%的突變率)，但是其價格很貴，由于靈敏度過高可能會導致假陽性，并且只能檢測有限的幾種突變，目前ARMS法可用于檢測BRAF V600E突變、KRAS突變和EGFR突變[35]。

2.2 分子檢測對甲狀腺癌臨床診斷的意義檢測甲狀腺癌分子標志物對于甲狀腺癌的早期診斷具有廣泛的意義和應用前景，可以預測甲狀腺癌的發(fā)病率并且為后續(xù)治療和預后估計提供便利，還可以協(xié)助FNAB來提高診斷結(jié)果的準確性。現(xiàn)可以對BRAF基因、RET/PTC重排和RAS基因等進行檢測，也有許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了其他基因如TERT基因和p53基因等在甲狀腺癌診斷和預測中的潛能。

BRAF基因點突變對于PTC是一個準確度極高的分子標志物，其檢出率可達83%，是甲狀腺癌中最常見的分子標志物[36]。同時，F(xiàn)NAB聯(lián)合BRAF V600E檢測能提高PTC的診斷敏感性和特異性[37]。因此，對于PTC患者， FNAB聯(lián)合BRAF V600E檢測是一種更加可靠的診斷手段，并且術(shù)前測試BRAF V600E對指導手術(shù)切除范圍有著重要意義。同時，BRAF V600E突變的發(fā)生明確提示PTC預后不良，BRAF V600E作為一個潛在的PTC預后指標在以往的研究中已得到證實。研究[38]顯示：BRAF V600E突變占PTC總患病人數(shù)的45.7%(845/1 849)，但是在56例PTC死亡病例中，有45例(80.4%)BRAF V600E突變?yōu)殛栃?，說明BRAF V600E突變與PTC患者死亡有關(guān)聯(lián)。

RET/PTC重排在早期甲狀腺癌中有較高的表達水平，該基因檢測輔助FNAB的應用是臨床預測PTC的重要指標，提高了分子標志物檢測的靈敏度，RET/PTC重排可以成為FNAB的補充性診斷依據(jù)[39]，并且對于兒童PTC和因輻射所致的PTC有一定的指導意義[40-41]。除此之外，RET/PTC重排不僅出現(xiàn)于PTC中，還可見于一些良性疾病如橋本氏甲狀腺炎和良性甲狀腺結(jié)節(jié)中，能夠有效地對以上疾病的發(fā)生和發(fā)展進行預測或者病因?qū)W的推斷。

在對RET突變進行基因篩查中了解到，RET基因突變攜帶者患多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2型(multiple endocrine neoplasia 2a，MEN2a)綜合征的風險增加，該疾病表現(xiàn)為同時發(fā)生MTC、嗜鉻細胞瘤和甲狀旁腺增生。MEN2a占所有遺傳性MTC的80%，可以預見：對RET基因突變進行篩查可以早期預測和診斷FMTC[42]。

RAS突變陽性的甲狀腺癌偏向于FTC和濾泡型甲狀腺乳頭狀癌(follicular variant of papillary thyroid carcinoma，F(xiàn)VPTC)，二者在形態(tài)學評估時很有可能會出現(xiàn)混淆而導致假陰性結(jié)果，所以RAS突變的檢測在FTC和FVPTC患者的診斷過程中有很高的價值，尤其是在有FNAB樣本的前提下。因此，采取措施對RAS基因進行篩查，對指導甲狀腺癌的治療也有重要的意義。Gupta等[43]對于來自66位患者的68例樣本進行分析得出結(jié)論：多數(shù)RAS基因突變陽性的甲狀腺癌患者缺乏確切的超聲診斷標準，且多為組織學上低分化的PTC，并且常為甲狀腺雙側(cè)癌。所以在臨床上可以對術(shù)前行甲狀腺細針穿刺檢測RAS基因陽性的患者行甲狀腺全切術(shù)，但是對于是否要進行預防性的淋巴結(jié)清掃尚無明確的結(jié)論。RAS基因在甲狀腺癌中的出現(xiàn)與BRAF基因在一定程度上是互相排斥的，可用于檢測BRAF V600E突變陰性的甲狀腺腫瘤，從而評價腫瘤的良惡性。An等[44]分析了155例BRAF V600E陰性的甲狀腺腫物(包括90例良性結(jié)節(jié)和65例不確定結(jié)節(jié))的RAS基因第61位密碼子突變，用以評估RAS基因突變診斷惡性腫瘤的準確性，結(jié)果顯示：在65例未定性BRAF V600E陰性的甲狀腺腫物中，25例出現(xiàn)RAS基因突變，占總數(shù)的38.5%。其中18例NRAS突變(72%)，7例HRAS突變(28%)；90例細胞學判定為良性的腫瘤中只有5例RAS基因檢測為陽性；在25例RAS突變陽性的未定性結(jié)節(jié)中僅2例超聲診斷結(jié)果為惡性(8%)；在15例接受手術(shù)的NRAS陽性未定性結(jié)節(jié)患者中有14例術(shù)后病理結(jié)果為惡性，包括13例FVPTC和1例FTC。該研究結(jié)果表明：RAS基因突變分析可作為在細胞學和超聲診斷中不確定以及BRAF V600E陰性的FVPTC的術(shù)前診斷工具。另外，對于甲狀腺結(jié)節(jié)患者，出現(xiàn)RAS突變陽性表示病變?yōu)閻盒缘母怕瘦^大[45]。研究[46]顯示：RAS突變患者中遠端轉(zhuǎn)移的頻率增加，但是由于大多數(shù)研究的統(tǒng)計數(shù)量較少和隨訪期限較短，尚不可能確定RAS突變本身具有預后價值。

TERT啟動子突變對于甲狀腺腫物FNAB結(jié)果模糊不清的結(jié)節(jié)具有潛在的診斷意義，對TERT基因檢測的特異性高(約100%)，但敏感性卻極低(約7%～10%)；當TERT啟動子突變與其他基因突變聯(lián)合檢測時，尤其是與BRAF V600E和RAS突變聯(lián)合檢測時，其敏感性可明顯提高[47]。

目前，F(xiàn)NAB是評估甲狀腺結(jié)節(jié)的金標準，但約20%～30%的甲狀腺結(jié)節(jié)無法被FNAB明確診斷，通常被報道為良惡性不確定。由于對此類結(jié)節(jié)缺乏明確的診斷手段，臨床上建議大部分患者接受診斷性手術(shù)從而確定疾病的性質(zhì)。臨床上已經(jīng)開展了對于疑似甲狀腺癌患者進行一些基因檢測，以便對不確定的結(jié)節(jié)進行傾向性預測，用來輔助診斷和治療。但基因診斷尚未作為一項獨立的診斷方法在甲狀腺癌的診斷中起到核心作用[3]。

在此基礎(chǔ)上發(fā)展更多的相應基因檢測手段也十分重要，成功地檢測出各種標志性基因?qū)τ谠缙诩谞钕侔┑脑\斷有著重要意義。目前，對于甲狀腺癌的診斷不能獨立于某項單一的標準，多基因聯(lián)合檢測比單一基因檢測更能提高診斷準確率；對FNAB組織進行多個基因的聯(lián)合檢測能夠更早地發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌，并且預測高風險人群，從而選擇更加合適的治療手段，完善個體化治療方案?，F(xiàn)有的基因檢測及分析手段在基因篩查中顯示出較高的特異性，但是在敏感性上依然有欠缺。未來會有新的更加高效準確的基因檢測手段對現(xiàn)有的甲狀腺癌相關(guān)基因以及一些新的突變進行檢測，在臨床上起到預測和診斷的作用[48]。

總之，甲狀腺癌病因?qū)W研究尚不明確，主要致病因素并不十分清楚。隨著甲狀腺癌分子生物學研究的進展，將會認識到更多甲狀腺癌基因?qū)用娴陌l(fā)病機制，并且出現(xiàn)更加有效率的檢測手段。