臨床待輸血患者RhE抗原和不規(guī)則抗體的檢測及其臨床意義

王曉寧，趙 震，劉 冰，李凌波

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院輸血科，吉林 長春 130021；2.吉林省長春市博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林 長春130102)

目前已確認(rèn)的人類血型系統(tǒng)已達(dá)36個(gè)[1]，Rh系統(tǒng)是其中最復(fù)雜的血型系統(tǒng)，包含了54種Rh血型抗原[2]，5種主要抗原Rh，即D、C、E、c和e與臨床輸血有密切關(guān)聯(lián)，抗原陰性的患者接受相應(yīng)抗原陽性的供者血液會(huì)產(chǎn)生ABO系統(tǒng)以外的抗體，即紅細(xì)胞不規(guī)則抗體，這種抗原抗體的不匹配可導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生[3]。由于Rh系統(tǒng)具有遺傳多態(tài)性，不同種族地域人群Rh血型抗原分布頻率不盡相同，產(chǎn)生的不規(guī)則抗體也具有差異性。研究[4-5]顯示：近20年來中國不規(guī)則抗體篩查陽性(抗篩陽性)患者人群中以抗-E抗體最多(占33.9%)，抗-E抗體的多發(fā)與RhE抗原分布及其不匹配輸血有關(guān)。目前，國外對紅細(xì)胞異源免疫的研究多集中在C/c、E/e、K、Fya和Jkb等抗原是否匹配上[6]，而中國人群由于RhE抗原陰性和陽性分布較均衡，導(dǎo)致異源免疫多發(fā)生于臨床上有免疫史的E抗原陰性人群，如國內(nèi)已有研究探討了RhE抗原陰性孕婦妊娠和生產(chǎn)次數(shù)與抗-E抗體產(chǎn)生的相關(guān)性[7]。與上述研究不同，為了解待輸血患者人群RhE抗原分布情況、患者是否有免疫史及其與不規(guī)則抗-E抗體產(chǎn)生的關(guān)系，本研究采用微柱凝膠法對10 000例住院患者血樣進(jìn)行了RhE抗原檢測及不規(guī)則抗體篩查和鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2015年2—12月吉林大學(xué)第一醫(yī)院住院待輸血的手術(shù)患者、非手術(shù)患者、孕婦和部分新生兒血液樣本，排除門診患者及免疫史(輸血和/或妊娠史)不明確患者。血液標(biāo)本共10 000例，其中男性4 856例，女性5 144例；年齡最小1歲，最大97歲；有臨床免疫史(輸血和妊娠史)患者5 120例，無臨床免疫史患者4 880例。

1.2 試劑和儀器ABODE血型檢測卡(微柱凝膠)、抗人球蛋白檢測卡(不規(guī)則抗體篩檢)、ABO血型反定型試劑盒(人血紅細(xì)胞)、不規(guī)則抗體檢測試劑(人血紅細(xì)胞)和低離子強(qiáng)度鹽溶液(LISS)均由吉林省長春市博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；紅細(xì)胞血型抗體鑒定細(xì)胞(10人份，所含主要抗原有D、C、E、c、e、M、N、S、s、P1、Lea、Leb、K、k、Fya、Fyb、Jka和Jkb)，由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)。以上所有試劑均在效期內(nèi)使用。FYQ型免疫微柱孵育器和TD-A型血型血清學(xué)用離心機(jī)由吉林省長春市博研醫(yī)學(xué)生物儀器公司生產(chǎn)。

1.3 方 法①標(biāo)本ABO、RhD和RhE血型檢測：采集患者靜脈血樣本，患者血樣加入含EDTA抗凝劑的試管中。將采集的標(biāo)本配制成0.8%紅細(xì)胞生理鹽水懸液。將ABODE血型檢測卡(微柱凝膠)做標(biāo)記，按照ABODE血型檢測卡(微柱凝膠)說明書操作。使用專用離心機(jī)離心5 min(900 r·min-1離心2 min，1 500 r·min-1離心 3 min)，肉眼判定結(jié)果。待檢者紅細(xì)胞與抗體結(jié)合在微柱凝膠中形成的特異性抗原抗體復(fù)合物浮在凝膠表面或膠中為陽性反應(yīng)，說明待檢者紅細(xì)胞表面有相應(yīng)的抗原；待檢者紅細(xì)胞不與抗體結(jié)合無特異性抗原抗體復(fù)合物形成，游離的紅細(xì)胞沉于微柱凝膠的底部為陰性反應(yīng)，說明待檢者紅細(xì)胞表面無相應(yīng)的抗原。②標(biāo)本不規(guī)則抗體篩查：患者靜脈血采入無抗凝劑試管中，37℃放置2 h后2 000 r·min-1離心10 min，取上清。使用低離子強(qiáng)度鹽溶液(LISS)將1號(hào)至3號(hào)O型篩選紅細(xì)胞配制成0.8%懸液，將抗人球蛋白檢測卡(不規(guī)則抗體篩檢)的微管作好標(biāo)記，按照試劑卡說明書進(jìn)行操作。試劑卡置于37℃孵育15 min。即刻使用專用離心機(jī)離心5 min(900 r·min-1離心2 min，1 500 r·min-1離心3 min)，肉眼判定結(jié)果。陰性、陽性結(jié)果判斷同上。1～3號(hào)管均呈陰性結(jié)果，表明被檢血清中不含有該標(biāo)準(zhǔn)O型篩選紅細(xì)胞抗原特異性的IgG類不完全抗體；1～3號(hào)管中有1管及1管以上呈陽性結(jié)果，表明被檢者血清中含有該標(biāo)準(zhǔn)O型篩選紅細(xì)胞抗原特異性的IgG類不完全抗體。③不規(guī)則抗體鑒定：檢測到不規(guī)則抗體為陽性的標(biāo)本用1～10 號(hào)譜細(xì)胞進(jìn)行微柱凝膠法抗體特異性鑒定。采用微柱凝膠抗球蛋白技術(shù)分別與由10人份O型紅細(xì)胞組成的譜紅細(xì)胞及自身紅細(xì)胞(均為0.8%低離子懸液)反應(yīng)。與譜紅細(xì)胞中1至數(shù)人份凝集，與自身紅細(xì)胞不凝集者為抗體陽性，并根據(jù)與譜紅細(xì)胞的反應(yīng)格局判定抗體的特異性。與自身紅細(xì)胞凝集者，應(yīng)用巰基試劑(2-ME)排除自身冷凝集素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。RhE抗原在不同ABO血型中的陰性率比較、不同性別患者不規(guī)則抗體的陽性率比較和檢出不規(guī)則抗體的患者有無臨床免疫史(輸血和/或妊娠史)的比率均以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 患者標(biāo)本RhE抗原檢測結(jié)果10 000例患者標(biāo)本中，RhE抗原陽性率51.46%(5 146/10 000)，RhE抗原陰性率48.54%(4 854/10 000)，RhE抗原在不同ABO血型中的陰性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.107，P=0.550)。見表1。

2.2 患者標(biāo)本不規(guī)則抗體篩查結(jié)果 10 000例患者標(biāo)本中產(chǎn)生不規(guī)則抗體者78例，陽性率0.78%。不規(guī)則抗體陽性標(biāo)本中，男性22例，陽性率0.45%(22/4 856)；女性56例，陽性率1.09%(56/5 144)。不同性別患者間比較，女性患者不規(guī)則抗體陽性率高于男性(χ2=13.039，P<0.01)。

表1 RhE抗原檢測結(jié)果及其在ABO不同血型中的分布

2.3 78例不規(guī)則抗體陽性患者單一性抗體陽性率及其與臨床免疫史(輸血史和妊娠史)的關(guān)系 78例不規(guī)則抗體中紅細(xì)胞同種抗體68例，自身抗體10例。紅細(xì)胞同種抗體中Rh系統(tǒng)抗體46例，所占構(gòu)成比最高(58.97%)。全部抗體中抗-E抗體最多(18例，23.08%)，18例檢出抗-E抗體患者中17例有臨床免疫史，在有臨床免疫史患者中檢出率為0.33%(17/5 120)，與無免疫史患者檢出率(0.02%,1/4 880)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.497，P<0.01)。檢出的全部Rh系統(tǒng)單獨(dú)抗體在有臨床免疫史患者中檢出率為0.84%(43/5 120)，與無免疫史患者檢出率(0.06%，3/4 880)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.060，P<0.01)。有無臨床免疫史患者中抗-M抗體[χ2=1.110(校正)，P=0.500]和自身抗體[χ2=1.810(校正)，P=0.180]檢出率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余抗體因檢出數(shù)過少未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見表2。

表2 單一性抗體陽性率及其與臨床免疫史(輸血史和妊娠史)的關(guān)系

Tab.2 Positive rates of single antibodies and their correlations with clinical immunization history (blood transfusion and pregnancy history)

Antibody n Positive rate(η/%) Immunization historyn Positive rate(η/%) No history of immunizationn Positive rate(η/%)Anti-E18 23.08 17 0.331 0.02Anti-D10 12.82 9 0.181 0.02Anti-cE6 7.696 0.12 0 0.00Anti-C5 6.415 0.100 0.00Anti-e3 3.852 0.041 0.02Anti-c3 3.853 0.060 0.00Anti-Ce1 1.281 0.020 0.00Anti-M8 10.266 0.122 0.04Anti-Leb3 3.851 0.022 0.04Anti-Fya2 2.560 0.002 0.04Anti-Jka2 2.562 0.040 0.00Anti-Dia2 2.562 0.040 0.00Anti-Mur2 2.562 0.040 0.00Anti-N1 1.281 0.020 0.00Anti-C and Anti-M1 1.281 0.020 0.00Anti-E andAnti-Leb1 1.281 0.020 0.00Autoantibody10 12.823 0.067 0.14Total78 100.0062 1.2116 0.33

3 討 論

紅細(xì)胞血型不規(guī)則抗體一般由人類紅細(xì)胞作為抗原刺激引起同族免疫作用而產(chǎn)生，輸注不配合的血液可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，尤其是有輸血史的患者，可以激活以前不能被檢出的抗體再次產(chǎn)生。近年來研究[8-9]顯示:紅細(xì)胞異源免疫是臨床依賴輸血患者的一個(gè)重要并發(fā)癥，并認(rèn)為紅細(xì)胞不規(guī)則抗體導(dǎo)致的溶血性輸血反應(yīng)是輸血相關(guān)死亡的重要原因。鑒于不配合血液輸注導(dǎo)致的不規(guī)則抗體產(chǎn)生病例呈現(xiàn)的上升趨勢，國際輸血協(xié)會(huì)在2011 年發(fā)布的關(guān)于非傳染性輸血反應(yīng)定義的標(biāo)準(zhǔn)中，將非傳染性輸血反應(yīng)中的遲發(fā)型血清反應(yīng)(delayed serologic reaction，DSTR)作為3種溶血性輸血反應(yīng)的一種，正式定義為“輸血后產(chǎn)生新的具有臨床意義的紅細(xì)胞抗體且不伴有臨床和實(shí)驗(yàn)室溶血征兆的同種異體免疫反應(yīng)”[10]。

紅細(xì)胞不規(guī)則抗體中，Rh系統(tǒng)抗體均由免疫刺激產(chǎn)生，而Rh系統(tǒng)抗-E抗體則是近年來中國患者人群中最常檢出的抗體[4,11-12]，可能與中國人群RhE抗原陰陽性分布接近及未實(shí)現(xiàn)RhE的同型輸注有關(guān)[5,13]。本研究結(jié)果顯示:10 000例住院患者標(biāo)本RhE抗原陰性4 854例，陰性率48.54%，陽性5 146例，陽性率51.46%，與文獻(xiàn)[5,13]報(bào)道吉林地區(qū)患者RhE陰陽性分布基本一致，間接證實(shí)了上述研究的部分推論。但RhE抗原在不同ABO血型中的陰性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與ABO系統(tǒng)和Rh系統(tǒng)均為獨(dú)立遺傳的血型系統(tǒng)有關(guān)。

我國2000年版《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》只要求輸血患者常規(guī)檢測ABO血型(正、反定型)和RhD抗原，對RhE抗原無明確要求。由于我國人群RhE陰性頻率遠(yuǎn)高于RhD陰性頻率，患者輸血前又無相應(yīng)的預(yù)防措施，從而使RhE抗原陰性患者受同種免疫概率大大增加[13]，產(chǎn)生的不規(guī)則抗體常在臨床導(dǎo)致疑難配血或造成嚴(yán)重后果。本研究對10 000例患者標(biāo)本進(jìn)行了不規(guī)則抗體檢測并鑒定，發(fā)現(xiàn)不規(guī)則抗體陽性78例，陽性率0.78%；經(jīng)鑒定其中Rh系統(tǒng)抗體占58.97%，檢出的全部Rh系統(tǒng)單獨(dú)抗體在有臨床免疫史患者中檢出率為0.84%(43/5 120)，與無免疫史患者檢出率0.06%(3/4 880)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且在全部檢出抗體中抗-E抗體最多(23.08%)，檢出的18例抗-E抗體的患者中17例有輸血或妊娠史，與無免疫史患者檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明包括抗-E抗體在內(nèi)的Rh血型系統(tǒng)抗體主要產(chǎn)生在具有輸血和妊娠等臨床免疫史患者中，提示對于有輸血史和妊娠史的臨床患者，應(yīng)對其進(jìn)行同種抗體的篩查和鑒定，具備條件時(shí)可在這些患者中采用RhE等Rh系統(tǒng)抗原同型輸注，以降低機(jī)體產(chǎn)生Rh系統(tǒng)同種抗體的概率。

不規(guī)則抗體產(chǎn)生的原因?yàn)檩斞?或)妊娠而產(chǎn)生的紅細(xì)胞同種免疫。妊娠可產(chǎn)生免疫應(yīng)答，故女性產(chǎn)生不規(guī)則抗體及發(fā)生溶血反應(yīng)的機(jī)會(huì)大于男性[14]。本研究中，不同性別不規(guī)則抗體陽性率不同，女性陽性率高于男性。提示在臨床工作中要特別注意需要輸血的女性患者，對于非RhD抗原引起的同種免疫反應(yīng)要引起臨床重視。在法國，常規(guī)對獻(xiàn)血者和受血者進(jìn)行ABO、Rh和Kell 系統(tǒng)表現(xiàn)型鑒定，并規(guī)定對50歲以下女性輸血必須實(shí)現(xiàn)Rh和Kell系統(tǒng)的匹配(包括RhC、RhE、Rhc、Rhe和K抗原)，以避免不規(guī)則抗體產(chǎn)生帶來不利后果[15]。近年來，輸血相關(guān)紅細(xì)胞同種異源免疫問題在發(fā)達(dá)國家愈來愈引起重視，一些研究者[9]提出了輸血前表現(xiàn)型的擴(kuò)展性匹配(extended matched，EM)，即將僅ABO、RhD同型匹配擴(kuò)展到RhC、RhE、Rhc、Rhe、K、Fya、Jka和S等抗原的匹配，可有效防止不規(guī)則抗體的形成或形成后帶來的負(fù)面作用，但這種精準(zhǔn)的匹配需立足于大規(guī)模的血清學(xué)篩查或大規(guī)模的基因分型[16]，就使得尋找合適供者的工作變得更加困難，因此目前這種表現(xiàn)型匹配在國外僅應(yīng)用于特定的患者群體，如鐮狀細(xì)胞性貧血或β-地中海貧血患者等[17-18]。

母親血型抗體引起的新生兒溶血癥及輸血的安全性，均以血型抗體為核心。林媽利等[19-20]對于輸血前常規(guī)篩檢血型抗原的問題曾提出根據(jù)抗體出現(xiàn)頻率的高低，判定其在當(dāng)?shù)氐呐R床意義，該觀點(diǎn)得到國內(nèi)外輸血界的贊同和肯定。對于中國患者而言，鑒于不規(guī)則抗-E抗體的多發(fā)性，應(yīng)同白種人預(yù)防抗-D抗體類似，做到在輸血前對患者和獻(xiàn)血者常規(guī)檢測RhE抗原，對二者RhE抗原準(zhǔn)確分型，實(shí)現(xiàn)ABO、RhD和RhE的匹配性輸血，才可從源頭上降低不規(guī)則抗-E抗體的陽性率，并避免產(chǎn)生抗-E抗體給患者再次輸血帶來困難，促進(jìn)臨床輸血安全。