菩人丹超微粉對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用及其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

王海彬，董志軍，郭立濤，石 晶，董微麗

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北 承德 067000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病引致視網(wǎng)膜微血管病變和神經(jīng)組織病變的常見(jiàn)并發(fā)癥，是導(dǎo)致視力損害的重要原因，近年來(lái)DR的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。研究[2-3]表明：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2)作為防治DR的重要標(biāo)志，可反映視網(wǎng)膜組織的損傷程度。另有研究[4-5]表明：晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)/核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路在DR過(guò)程中起重要作用。

菩人丹超微粉(Purendan Superfine Powder,簡(jiǎn)稱PRD)是以苦瓜為君藥，以人參和丹參為臣藥，加以制首烏、水蛭和葛根配伍組成的中藥復(fù)方，具有益氣養(yǎng)陰清熱、活血化瘀通絡(luò)之功效。研究[6]表明：PRD對(duì)病機(jī)為“熱、虛、瘀”的糖尿病患者有明顯療效。但目前尚無(wú)有關(guān)PRD對(duì)DR影響的相關(guān)機(jī)制的研究。為進(jìn)一步探討PRD對(duì)DR的保護(hù)作用，本研究主要觀察PRD對(duì)糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和Ang-2蛋白表達(dá)的影響，并從AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路探討PRD對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器 PRD(河北以嶺藥業(yè)集團(tuán)有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)，VEGF和Ang-2引物序列(上海生工生物工程有限公司)，兔抗VEGF 抗體(美國(guó)Cell Signalling公司)，Ang-2、AGEs和RAGE抗體(英國(guó)Abcam公司)，NF-κB P65(美國(guó)CST公司)，抗兔辣根過(guò)氧化物酶(HRP，上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司)。OneTouch?UltraVue血糖儀(上海強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)，電泳儀(西安東澳生物科技有限公司)，圖像分析軟件Quantity One 4.3.1(美國(guó)Bio-rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組和給藥 雄性Wistar大鼠40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(冀) 2016-0002。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)室溫度22℃～28℃，相對(duì)濕度60%～78%。40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、低劑量PRD組和高劑量PRD組，每組10只。模型組、低劑量PRD組和高劑量PRD組大鼠禁食12 h后，腹腔注射2% STZ(60 mg·kg-1)，每天1次，制備糖尿病動(dòng)物模型。連續(xù)注射3 d后空腹后取鼠尾血，采用血糖儀測(cè)定血糖，以血糖水平≥16.7 mmol·L-1為糖尿病大鼠模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。待模型成功建立后，低劑量和高劑量PRD組大鼠分別灌胃給予1.2和2.4 g·kg-1PRD ，大鼠給藥劑量根據(jù)成人給藥劑量按體表面積換算，大鼠每日等效劑量(g·kg-1)=6.3×成人每日劑量(g·kg-1)，自造模成功起連續(xù)給藥3個(gè)月。正常對(duì)照組、模型組大鼠分別灌胃給予等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)水和進(jìn)食，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.3 標(biāo)本收集 大鼠禁食12 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉，打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈置管，取血測(cè)定血糖，用生理鹽水灌洗至眼球蒼白，迅速摘除雙眼眼球，去除眼前節(jié)及玻璃體，于顯微鏡下鈍性分離視網(wǎng)膜組織，置于-80℃下儲(chǔ)存，用于實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blotting法檢測(cè)。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達(dá)水平 提取視網(wǎng)膜組織總RNA，按照Thermo公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)，以β-actin基因的表達(dá)作為內(nèi)參照。目的基因VEGF和Ang-2引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。PCR結(jié)束后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的基因cDNA片段的質(zhì)量，凝膠成像系統(tǒng)分析，以PCR產(chǎn)物的DNA擴(kuò)增條帶的灰度值和內(nèi)參物擴(kuò)增條帶灰度值的比值作為VEGF和Ang-2 mRNA表達(dá)水平。

表1 VEGF和Ang-2引物序列

1.5 Western blotting法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中AGEs、RAGE、NF-кB、VEGF和Ang-2蛋白表達(dá)水平 取液氮中保存的視網(wǎng)膜組織，加入PBS(0.01 mmol·L-1，pH7.4)1 mL于勻漿器中冰浴下勻漿， 4℃、6 000 r·min-1離心30 min，棄上清，向沉淀物中加入200 μL全細(xì)胞裂解液冰浴裂解 40 min，4℃、12 000 r·min-1高速離心15 min，收集上清液，按照試劑盒方法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量，蛋白上樣量為50 μg，12% SDS-PAGE凝膠電泳，80～120 V、2 h，電泳完畢后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(孔徑0.45 μm，美國(guó)Pall公司)上；5%脫脂奶粉TBST封閉2 h；加入AGEs(1∶1 000)、RAGE(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、VEGF(1∶200)和Ang-2(1∶200)抗體，PVDF膜用0.5% TBS-T溶液洗膜3次，每次5 min，用二抗辣根過(guò)氧化物酶(HRP,1∶5 000)交聯(lián)物室溫?fù)u床孵育1 h，0.5% TBS-T溶液洗膜3次后，顯影，對(duì)顯影條帶進(jìn)行灰度分析，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2條帶與GAPDH條帶的灰度值比值，代表目的蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖水平 各組大鼠注射STZ造模24 h后出現(xiàn)多食、多飲和多尿表現(xiàn)，48 h后出現(xiàn)體質(zhì)量下降和行動(dòng)遲緩。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)，血糖水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低和高劑量PRD組大鼠體質(zhì)量明顯升高(P<0.05)，血糖水平明顯降低(P<0.05)；與治療前比較，治療后低和高劑量PRD組大鼠血糖水平明顯降低(P<0.05)，高劑量PRD組較低劑量PRD組降糖效果更佳。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量和血糖水平

GroupBody weight(m/mg)Before treatmentAfter treatmentBlood glucose[cB/(mmol·L-1)]Before treatmentAfter treatmentNormal control224.05±11.55285.94±12.346.10±4.566.67±2.83Model201.41±9.36?206.31±24.61?21.74±1.93?23.74±5.30?PRD Low dose 204.31±8.04?253.83±11.29△20.88±2.37?15.03±2.73△# High dose 203.53±10.34?275.55±15.36△21.56±2.53?14.64±2.69△#

*P<0.05 compared with normal control group;△P<0.05 compared with model group;#P<0.05 compared with before treatment.

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達(dá)水平 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低和高劑量PRD組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，高劑量PRD組較低劑量組降低更明顯。見(jiàn)圖1和表3。

Lane 1: Normal control group;Lane 2: Model group;Lane 3:Low dose of PRD group； Lane 4:High dose of PRD group.

圖1 RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of VEGF and Ang-2 mRNA in retinal tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達(dá)水平

GroupVEGF mRNAAng-2 mRNANormal control0.73±0.020.68±0.04Model1.18±0.03?1.14±0.07?PRD Low dose 1.08±0.01△0.95±0.05△ High dose 0.90±0.02△0.75±0.04△

*P<0.05 compared with normal control group;△P<0.05 compared with model group.

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表達(dá)水平 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量和高劑量PRD組大鼠視網(wǎng)膜AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，高劑量PRD組較低劑量PRD組降低更明顯。見(jiàn)圖2和表4。

Lane 1: Normal control group；Lane 2: Model group；Lane 3:Low dose of PRD group ；Lane 4:High dose of PRD group.

圖2 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of AGEs,RAGE,NF-κB,VEGF， and Ang-2 proteins in retina tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表達(dá)水平

GroupsAGEsRAGENF-кBVEGFAng-2Normal control0.29±0.020.33±0.010.45±0.040.48±0.030.42±0.03Model0.46±0.04?0.59±0.01?0.91±0.04?1.01±0.04?0.95±0.04?PRD Low dose 0.38±0.02△0.43±0.04△0.74±0.03△0.70±0.01△0.76±0.02△ High dose 0.33±0.01△0.36±0.01△0.64±0.01△0.58±0.02△0.63±0.02△

*P<0.05 compared with normal control group;△P<0.05 compared with model group.

3 討 論

糖尿病歸屬為中醫(yī)“消渴”，病機(jī)特點(diǎn)為“陰虛為本，燥熱為標(biāo)；氣陰兩傷，陰陽(yáng)俱虛；變證百出，常夾血瘀”，其中“熱”“虛”“瘀”為發(fā)病的關(guān)鍵[9-10]。中藥治療主要遵循“清熱”“補(bǔ)虛”“祛瘀”療法。PRD由苦瓜、人參、丹參、首烏、水蛭和葛根配伍組成，方中人參、首烏補(bǔ)氣養(yǎng)血，丹參、水蛭活血化瘀，苦瓜、葛根清熱涼血兼明目，各中藥配伍使用，達(dá)到清熱和營(yíng)、祛瘀通絡(luò)的目的。

DR損傷的特征包括內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血視網(wǎng)膜屏障、視網(wǎng)膜血流量變化、局部缺血和新血管化[11-12]。研究[13]顯示：DR的損傷程度與VEGF和Ang-2有密切關(guān)聯(lián)。VEGF是一種血管生成因子和促炎癥因子，對(duì)視網(wǎng)膜組織血管生成和水腫的發(fā)生有明顯影響[14]。Ang-2作為一種促血管生成素，與VEGF具有協(xié)同作用，可增加視網(wǎng)膜血管通透性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和慢性炎癥的發(fā)生[15-16]。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高，說(shuō)明模型建立成功；用藥后PRD組大鼠血糖水平明顯降低，同時(shí)VEGF和Ang-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，且高劑量PRD組大鼠降低更明顯，表明PRD對(duì)大鼠DR具有顯著療效。

DR過(guò)程中，視網(wǎng)膜組織可產(chǎn)生AGEs，AGEs通過(guò)增加血管內(nèi)皮通透性，促進(jìn)細(xì)胞因子釋放和活化蛋白激酶，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織病變[17]。NF-κB是一種廣泛存在于體內(nèi)多種細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的合成與釋放，在機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)、凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用[18]。AGEs特異性受體RAGE屬于免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面分子，可結(jié)合并降解AGEs。研究[19]證明：發(fā)生糖尿病和氧化應(yīng)激時(shí)，RAGE 表達(dá)可明顯升高。AGEs通過(guò)與RAGE結(jié)合激活NF-κB，同時(shí)NF-κB作為RAGE的啟動(dòng)子促進(jìn)AGEs與RAGE進(jìn)一步結(jié)合，產(chǎn)生正反饋?zhàn)饔肹20]。本研究結(jié)果顯示：PRD可明顯降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中AGEs、RAGE和NF-κB蛋白表達(dá)水平，表明PRD可降低AGEs的產(chǎn)生，抑制AGEs與RAGE結(jié)合，減少NF-κB的分泌，特異性阻斷AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路。

綜上所述，PRD對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用，下調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平，特異性阻斷AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路，減少視網(wǎng)膜微血管滲漏及病理性新生血管生成，減少AGEs形成，減輕炎癥反應(yīng)，是其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制之一。