高爾基體通過自噬調(diào)控成骨分化的研究進(jìn)展

孟許亞，布文奐,2，劉 杰,2，王 璐,2，于 爍，孫茂蕾,2，孫宏晨

(1.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院VIP綜合科，吉林 長春 130021)

骨類疾病是指骨的完整性和功能性遭到破壞，可由炎癥、外傷、腫瘤、感染和先天性疾病等因素引起。自噬是指細(xì)胞內(nèi)一些需降解的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等胞漿成分被包裹，最終被運送至溶酶體降解的過程，在一定條件下自噬可以促進(jìn)細(xì)胞成骨分化[1]。高爾基體最早發(fā)現(xiàn)于1898年，是一種重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的加工、分選、運輸和定向分泌到質(zhì)膜和溶酶體，并參與到自噬體的形成[2]。本文主要圍繞成骨分化、自噬和高爾基體三者的關(guān)系進(jìn)行簡要綜述。

1 自噬與成骨

出生后生物體骨組織的生長、發(fā)育、改建和修復(fù)主要依賴于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能協(xié)調(diào)，其中成骨細(xì)胞可以產(chǎn)生骨基質(zhì)蛋白，通過礦化促進(jìn)骨量的增加；破骨細(xì)胞則主要通過骨吸收引起骨量降低。研究[3]表明：自噬在成骨分化過程中發(fā)揮重要作用。

1.1 自噬相關(guān)的骨類疾病自噬作為近年來的研究熱點，已被證明其發(fā)生與機(jī)體多種骨類疾病均存在密切聯(lián)系。成骨不全癥是由Ⅰ型膠原缺陷引起的骨發(fā)育障礙性疾病，又稱脆骨病或脆骨-藍(lán)鞏膜-耳聾綜合征，主要作用的靶細(xì)胞是成骨細(xì)胞祖細(xì)胞，α1-Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ alpha 1，COL1A1) 和α2-Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ alpha 2，COL1A2) 基因突變引起自噬增加[4]。多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥可嚴(yán)重縮短軸向和垂直向骨骼，引起骨發(fā)育障礙和神經(jīng)退行性疾病，并伴發(fā)自噬體的增多[5]。包涵體肌病、佩吉特病和額顳葉癡呆是由含纈氨酸蛋白質(zhì)(valosin-containing protein，VCP)中的p97 / VCP基因突變引起的肌肉、腦和骨骼等多器官退化，可影響機(jī)體正常生理功能，同時伴發(fā)自噬流的減少[6-7]和自噬障礙。

1.2 自噬體相關(guān)基因和蛋白與成骨分化骨質(zhì)疏松癥作為一種常見的骨關(guān)節(jié)類疾病，主要由破骨細(xì)胞和小范圍的成骨細(xì)胞功能異常引起，表現(xiàn)為骨礦化程度降低、骨結(jié)構(gòu)紊亂和脆性增加，容易發(fā)生骨折。研究[4]表明：骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與多種自噬相關(guān)基因，如磷脂酰肌醇3激酶催化亞基3型(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3，PIK3C3)、自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，ATG) 中的ATG7、ATG5、ATG12及腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的α2亞基基因(PRKAA2)、 Beclin1、GABA A型受體相關(guān)蛋白1(GABA type A receptor associated protein like 1，GABARAPL1)和干擾素α13(interferon alpha 13，IFNα13)的異常表達(dá)有關(guān)。受體蛋白Brca1(neighbor of Brca1 gene protein，Nbr1)在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和出生后的骨骼重塑過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。Nbr1可以與自噬相關(guān)蛋白p62靶向泛素化底物到自噬體途徑[10]，并作為成骨細(xì)胞分化和骨發(fā)生的負(fù)向調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中的p38-絲裂源活化蛋白激酶(MAPK)依賴性的成骨細(xì)胞分化過程，其功能喪失可引起p62表達(dá)紊亂和p38-MAPK的過度激活[11]。此外，p62可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)活性[12]，也可以與p38-MAPK相互作用調(diào)節(jié)其活性[13]。Nbr1和p62通過調(diào)節(jié)不同細(xì)胞中的信號通路，在骨重建的調(diào)控中發(fā)揮重要作用；在臨床應(yīng)用方面，通過識別并阻斷Nbr1基因表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，增加骨量，從而達(dá)到治療疾病的目的。

骨重建是一個連續(xù)的生理過程，需要從間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)中恒定地產(chǎn)生新的成骨細(xì)胞。 MSCs的成骨細(xì)胞分化需要足夠的能量供應(yīng)，而線粒體是主要的供能細(xì)胞器，因此成骨細(xì)胞分化可引起線粒體呼吸作用增強(qiáng)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高。轉(zhuǎn)錄因子FOXO3是已知的自噬調(diào)節(jié)因子，通過自噬消除過量的ROS，發(fā)揮抗氧化作用，調(diào)控ROS穩(wěn)態(tài)，為MSCs提供重要的抗氧化防御機(jī)制，維持骨骼更新的平衡，確保產(chǎn)生新的成骨細(xì)胞，從而達(dá)到促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的目的[14]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是小的非編碼RNA，通過降解mRNA或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在干細(xì)胞自我更新、分化和多能性中發(fā)揮重要作用。miRNA作為細(xì)胞分化中的關(guān)鍵調(diào)控因子已成為近年來廣受關(guān)注的熱點。成骨細(xì)胞分化實驗[15]結(jié)果顯示：分化旺盛的細(xì)胞中miRNA-211表達(dá)水平高，阻斷這種miRNA的表達(dá)則成骨細(xì)胞的分化也明顯受到抑制；增強(qiáng)其表達(dá)可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。另外，miRNA-211抑制劑可以抑制分化細(xì)胞中的自噬體相關(guān)基因Atg14 mRNA和蛋白表達(dá)；miRNA-211模擬物可導(dǎo)致Atg14 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。因此推測miRNA-211可引起成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中的Atg14表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化的增加。

研究[16]表明：自噬對誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化有重要作用，AMPK可以通過激活成骨細(xì)胞分化所必需的自噬而刺激成骨，自噬空泡可作為成骨細(xì)胞中的載體分泌磷灰石晶體，促進(jìn)礦化，而自噬的缺乏會降低礦化能力。在體內(nèi)實驗中觀察到：成骨細(xì)胞特異性自噬缺陷小鼠的骨小梁減少50%。成骨細(xì)胞中的自噬涉及礦化過程和骨穩(wěn)態(tài)，自噬相關(guān)蛋白ATG7和Beclin1是成骨細(xì)胞礦化所必需的，原發(fā)性成骨細(xì)胞ATG5缺乏，使礦化能力降低并增加破骨細(xì)胞[17]。另外，在對MC3T3-E1細(xì)胞的研究[18]中，自噬的上調(diào)會導(dǎo)致其成熟和終末分化。以上研究均表明自噬是正常細(xì)胞成骨分化所必需的。

2 高爾基體與自噬

高爾基體是一種膜性囊泡結(jié)構(gòu)復(fù)合體，又稱扁平囊泡，其斷面微曲呈弓形，通常有3～8個扁平囊泡平行排列，聚簇成堆，構(gòu)成高爾基體的主體結(jié)構(gòu)；其凸面朝向細(xì)胞核，稱之為順面或形成面，位于高爾基體囊泡形成面的小囊泡系來自粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運輸小泡，一方面完成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，另一方面也使扁平囊泡的膜結(jié)構(gòu)及其內(nèi)含物得以不斷地更新和補(bǔ)充；其凹面朝向細(xì)胞膜，稱之為反面或成熟面。大囊泡也稱作分泌泡，見于扁平囊泡成熟面，由扁平囊泡末端膨大、離斷而形成。

真核生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解途徑主要分為2種：一種是依賴于蛋白酶體的小分子降解；另一種是依賴于自噬的大分子降解，通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，包裹要降解的物質(zhì)，與溶酶體融合，并最終被酶解[19]。自噬作為真核細(xì)胞中廣泛存在的降解和再循環(huán)系統(tǒng)，可由缺氧、營養(yǎng)缺乏、代謝、氧化和蛋白毒性應(yīng)激等應(yīng)激條件引起[20]。另外，研究[5，21]顯示：自噬作為細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)降解的主要方式，不僅在生物體正常發(fā)育、腫瘤抑制、病原體抗性和衰老中發(fā)揮重要作用，而且在幾種人類病理性疾病，如癌癥、糖尿病、心肌病和神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病和帕金森病)等發(fā)生過程中也發(fā)揮重要作用。

2.1 高爾基體與自噬體的形成自噬體是一種雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，隨著近年來對自噬體的研究，對其有了更深刻和全面的認(rèn)識。對自噬體相關(guān)蛋白在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位的研究[22]顯示：自噬體的形成與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體和細(xì)胞膜均有密切聯(lián)系。部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上無核糖體附著的結(jié)構(gòu)，可自身折疊形成隔離膜，隔離膜不斷延伸，最終閉合形成雙層膜的囊狀結(jié)構(gòu)的自噬體，這種位于2個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜之間的雙層膜結(jié)構(gòu)的隔離膜是自噬體形成的基礎(chǔ)。研究[23]顯示：細(xì)胞內(nèi)的膜運輸系統(tǒng)可能也在自噬體形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的膜性結(jié)構(gòu)ER-Golgi中間體(ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)，在一定條件(如饑餓)的刺激下，可以激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，促使Ⅱ型包膜蛋白(coat proteins Ⅱ，COPⅡ)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到ERGIC ，形成COPⅡ囊泡，作為LC3脂化的模板，是自噬發(fā)生的關(guān)鍵步驟。另外，ERGIC還可以促進(jìn)早期自噬體的標(biāo)記物自噬相關(guān)蛋白ATG14聚集，這是早期自噬體膜生成的關(guān)鍵一步，也是自噬體在體內(nèi)生成所必需的[24]，而Ⅰ型包膜蛋白(coat proteins Ⅰ，COPⅠ)主要參與自噬體的延伸和成熟[25]。

存在于細(xì)胞內(nèi)的保守的低聚高爾基體復(fù)合物(conserved oligomeric Golgi，COG)是一種異五聚體復(fù)合物，由8個亞基組成，分布在2個葉中。葉A含有COG2～4，葉B由COG5～8組成，COG1是連接2個葉的中央亞基。COG主要參與調(diào)節(jié)高爾基體轉(zhuǎn)運和維持真核細(xì)胞中高爾基體結(jié)構(gòu)的完整性，COG亞基定位于自噬體集合位點(phagophore assembly site，PAS)，通過與自噬體相關(guān)蛋白相互作用參與自噬體的形成[26]。

高爾基體磷酸化蛋白3(Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3)是一種位于反面高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(trans Golgi network，TGN)上的新型外周膜蛋白，主要參與維持高爾基體正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)、受體分選、糖基化修飾以及發(fā)生于TGN上的信號通路[27]。Li等[28]研究顯示：GOLPH3可作為高爾基體應(yīng)激的傳感器，也可作為向下游效應(yīng)器觸發(fā)和傳播特定高爾基體應(yīng)激信號的引發(fā)劑，在氧化應(yīng)激過程中迅速上調(diào)，并伴隨著高爾基體由位于細(xì)胞核周圍的壓實的帶狀結(jié)構(gòu)到廣泛分布于整個細(xì)胞質(zhì)中的囊泡樣結(jié)構(gòu)的改變。此外，高表達(dá)的GOLPH3可促進(jìn) LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，引發(fā)自噬和ROS產(chǎn)生。而ROS的過度積累會破壞細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，促進(jìn)自噬和細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2]。

2.2 高爾基體物質(zhì)轉(zhuǎn)運與自噬體的形成在自噬體的相關(guān)研究中，通常選擇轉(zhuǎn)染能表達(dá)綠色熒光蛋白的GFP-LC3質(zhì)粒，通過綠色熒光的點狀聚集標(biāo)記自噬體的形成。用熱敏感性的水泡型口炎病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，當(dāng)合成的蛋白質(zhì)離開高爾基體到達(dá)細(xì)胞膜時，有大量代表自噬體的LC3陽性囊泡形成；當(dāng)使用抑制劑或誘導(dǎo)形成突變體以抑制TGN上網(wǎng)格蛋白的形成時，可以明顯抑制高爾基體向細(xì)胞膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，同樣自噬體的形成也受到明顯抑制，提示TGN向細(xì)胞膜的蛋白轉(zhuǎn)運在自噬體的形成中發(fā)揮重要作用。TGN是早期LC3的組裝位點，當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3可以與特定的TGN膜結(jié)構(gòu)結(jié)合，然后從TGN上分離形成自噬體，這也從另外一個方面表明TGN很有可能為自噬體的形成提供膜來源[29]。

2.3 高爾基體與自噬體相關(guān)蛋白自噬體相關(guān)蛋白對自噬體的形成必不可少，其在細(xì)胞內(nèi)有廣泛的分布。在哺乳動物細(xì)胞中，自噬相關(guān)蛋白ATG9是一種六次跨膜蛋白，主要定位于TGN上，可以在TGN和早期核內(nèi)體之間循環(huán)[27]，對自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成必不可少。激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4(AP-4)作為一種參與真核細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分選的異源四聚體銜接蛋白復(fù)合物，可以促使ATG9A從TGN向外周細(xì)胞質(zhì)的輸出，有助于自噬蛋白LC3的脂化，作為自噬調(diào)節(jié)劑改變自噬[30-31]。駐留于高爾基體的小GTP酶Rab33B，可以與ATG 16L相互作用，是隔離膜形成的一個重要因素，兩者共同參與調(diào)控自噬體的形成[32]。

另外，自噬作為細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解過程，Beclin1也參與其中。Beclin1是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)ATG6蛋白的同源物，主要位于TGN上，并且可以作為第三類PI3K復(fù)合物的一部分發(fā)揮作用，調(diào)控其他自噬體相關(guān)蛋白定位到早期自噬體上[26]，對自噬體的形成起重要作用。另外，Beclin1引發(fā)的自噬也是成骨細(xì)胞終末分化的必要條件[33]。間接免疫熒光顯微鏡下可見：大多數(shù)Beclin1和PI3K共定位于TGN，并可發(fā)生免疫共沉淀，其對自噬的發(fā)生是必需的，二者共同調(diào)控自噬的發(fā)生。

運輸?shù)鞍最w粒(transport protein particle，TRAPP)復(fù)合體由TRAPPⅠ、TRAPPⅡ和TRAPPⅢ組成，分別在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體運輸、高爾基體運輸和自噬中起作用。其中，TRAPPⅢ主要在高爾基復(fù)合體上發(fā)揮功能，接受來自早期核內(nèi)體的逆向轉(zhuǎn)運囊泡，參與自噬前體結(jié)構(gòu)(PAS)的形成[34]，此外，參與自噬體形成的必不可少的ATG9的轉(zhuǎn)運也依賴于TRAPPⅢ[35]。

3 高爾基體和自噬在成骨分化中的作用

自噬在誘導(dǎo)和促進(jìn)成骨細(xì)胞分化方面具有重要作用，研究[3，16-17]證明：自噬是成骨細(xì)胞分化所必需的。高爾基體作為真核細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器，參與多種重要的蛋白質(zhì)，包括與自噬和成骨密切相關(guān)的多種蛋白質(zhì)的合成和定位，同時高爾基體作為自噬體形成的潛在的膜來源對自噬體形成有重要意義。但是，高爾基體是否可以以自噬為媒介與成骨分化產(chǎn)生某種聯(lián)系，目前尚無足夠的證據(jù)證明。另外，是否可以通過高爾基體調(diào)控自噬，取得更有效的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的效果，進(jìn)而被應(yīng)用于臨床骨類疾病的治療目前尚未明確。

4 展 望

大量研究[1，3，24，30]證明：高爾基體對于自噬的發(fā)生，以及自噬對于成骨細(xì)胞的分化均存在密切的聯(lián)系，是否可以以自噬為媒介，探討高爾基體在成骨分化過程中的作用是未來的研究方向。

納米材料因其具有超小粒徑、低毒性和良好的生物相容性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)方面的研究。納米材料被細(xì)胞攝取后，可在細(xì)胞內(nèi)引起一定程度的自噬。已知納米材料多由相應(yīng)的物質(zhì)經(jīng)過一系列復(fù)雜的反應(yīng)得到，可在一定程度上保持原物質(zhì)的性質(zhì)。研究[1]表明：活性二氧化硅刺激MC3T3-E1分化的過程與自噬存在著密切聯(lián)系?？箟难峋哂写龠M(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力[36-38]，那么用抗壞血酸合成的納米材料，是否也會保留其有促成骨細(xì)胞分化的性質(zhì)、是否也能引起自噬、以其引起的自噬和成骨效應(yīng)是否也具有某種聯(lián)系以及是否可以通過高爾基體調(diào)節(jié)自噬使其具有更好的促成骨能力等將在以后的研究中進(jìn)一步驗證。