牙髓干細(xì)胞增殖、分化和遷移的研究進(jìn)展

劉定坤, 楊 楠，金巨樓，孫夢(mèng)潔，王 倩，吳 佳，劉志輝

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春130021)

自2003年施松濤教授提取并分離出牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)之后，其作為一種可再生性間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生研究領(lǐng)域引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。臨床上，DPSCs易從阻生齒、多生牙以及正畸牙中的牙髓組織中提取。DPSCs在體外環(huán)境中易于培養(yǎng)，其傳代增殖后依然保存著良好的干細(xì)胞特性。對(duì)于輕、中度的牙齒損傷，DPSCs可遷移至損傷處，分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞參與反應(yīng)性牙本質(zhì)的形成。目前，國(guó)內(nèi)成功開展了國(guó)際上首個(gè)全長(zhǎng)牙髓再生的臨床研究，進(jìn)一步證明了DPSCs可作為種子細(xì)胞用于組織工程的可行性。本文對(duì)DPSCs的增殖、遷移以及分化的研究進(jìn)展做一綜述，以期為DPSCs在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)及臨床應(yīng)用方面的研究提供新的思路和策略。

1 DPSCs的生物學(xué)特征

牙髓是牙體組織的一部分，含有結(jié)締組織、間充質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)纖維、血管和淋巴等。Gronthos 等[1]收集了19～29 歲患者的第三磨牙，取出牙髓組織，用酶消化法得到單細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞可以自我增殖，其免疫表型與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowstromal stem cells，BMSCs) 相似，在體外一定條件下可形成礦化結(jié)節(jié)；將細(xì)胞植于免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，有牙本質(zhì)樣組織形成，證明其可分化為類成牙本質(zhì)細(xì)胞。且該細(xì)胞又具有高度增殖和克隆能力，因此將其命名為DPSCs，證實(shí)了牙髓組織中干細(xì)胞的存在。

2DPSCs的增殖

隨著近些年科學(xué)技術(shù)的提高，諸多學(xué)者不斷嘗試新的培養(yǎng)方式，如改變物理環(huán)境、化學(xué)藥物刺激和支架共培養(yǎng)等，用于研究DPSCs的增殖以及如何加快DPSCs的增殖速度。

2.1 物理效應(yīng) 在三維動(dòng)態(tài)模擬微重力、3D多孔培養(yǎng)、靜磁場(chǎng)和缺氧環(huán)境下培養(yǎng)等各種區(qū)別于正常的培養(yǎng)環(huán)境下，DPSCs的增殖速度均高于對(duì)照組。①三維動(dòng)態(tài)模擬微重力。Li 等[2]探討三維動(dòng)態(tài)模擬微重力環(huán)境中，人牙骨髓干細(xì)胞(hDPSCs)在裸鼠體內(nèi)乳酸-乙醇酸[poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)，PLGA]支架下的增殖及成牙本質(zhì)分化的能力，組織學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組中Ki-67、Ⅰ型膠原、牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白Ⅰ(dentin matrix protein-Ⅰ，DMPⅠ)表達(dá)均高于對(duì)照三維靜態(tài)培養(yǎng)組，表明在體內(nèi)三維動(dòng)態(tài)模擬微重力環(huán)境條件下培養(yǎng)，可提高h(yuǎn)DPSCs的增殖及成牙本質(zhì)分化能力。②3D多孔培養(yǎng)。Bhuptani 等[3]發(fā)現(xiàn)：多孔微支架可以為干細(xì)胞的生長(zhǎng)創(chuàng)造一個(gè)3D微環(huán)境，在體內(nèi)或體外控制其生長(zhǎng)。該實(shí)驗(yàn)使用互相關(guān)聯(lián)的多孔PLGA微支架促使DPSCs在體外增殖，觀測(cè)其生態(tài)學(xué)特征以及黏附性，并通過(guò)MTT和RT-PCR法檢測(cè)其增殖能力，結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組hDPSCs在平均增長(zhǎng)數(shù)高于2D對(duì)照條件培養(yǎng)；此外，細(xì)胞活性和基因表達(dá)結(jié)果證實(shí)：實(shí)驗(yàn)組hDPSCs的可塑性高于對(duì)照組hDPSCs可塑性，提示新型多孔微小支架作為三維培養(yǎng)基使組織干細(xì)胞工程更有前途。③靜磁場(chǎng)：Lew 等[4]通過(guò)在0.4 t靜磁場(chǎng)下hDPSCs和對(duì)照組分別培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：0.4 t磁場(chǎng)影響細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的活性，該效應(yīng)可以激活p38絲裂原活化蛋白酶信號(hào)通路，從而重組細(xì)胞骨架，促進(jìn)細(xì)胞增殖。④缺氧環(huán)境：Kanafi 等[5]發(fā)現(xiàn)：來(lái)源于脫落乳牙中的DPSCs相較于恒牙中的DPSCs在低氧環(huán)境中表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力。

2.2 化學(xué)藥物刺激及支架共培養(yǎng) 在培養(yǎng)環(huán)境中添加不同種類的物質(zhì)如胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factorⅠ，IGF-1)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)[6]和黃瓜籽正丁醇提取物[7]等，hDPSCs可表現(xiàn)出高于對(duì)照組的增殖速度，與支架材料的共培養(yǎng)也可以顯示出實(shí)驗(yàn)組的增殖速度明顯高于對(duì)照組。①生物膜。Soares 等[8]將膠原凝膠與殼聚糖溶液(2∶1)混合，再加入活性鋁酸鈣水泥形成礦物相的生物膜作為實(shí)驗(yàn)組，惰性材料聚苯乙烯作為對(duì)照組，將hDPSCs接種于2種材料的表面，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組hDPSCs的增殖速度明顯高于對(duì)照組。②不同支架材料。Khojasteh 等[9]通過(guò)評(píng)估市場(chǎng)上提供的4種支架材料[SureOss、Cerabone、聚L-乳酸(PLLA)和OSTEON]對(duì)hDPSCs的黏附性、增殖及分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除SureOss外，所有生物支架材料均促進(jìn)hDPSCs黏附、增殖和分化，接種于聚PLLA支架上的細(xì)胞表現(xiàn)出的增殖和黏附性最高。

2.3 其他 DPSCs的增殖與機(jī)體生長(zhǎng)階段也有關(guān)。Ling 等[10]通過(guò)觀察未成熟比格犬前磨牙不同程度的不可逆牙髓炎，早期DPSCs的增殖及成骨分化潛能強(qiáng)于后期。不同生長(zhǎng)因子對(duì)DPSCs的增殖、分化和遷移等有著不同的作用。Wen 等[11]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)比較基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 (stromal cell-derived factor-1，SDF-1)與粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)對(duì)hDPSCs增殖、遷移及分化的影響，結(jié)果顯示：與G-CSF比較，SDF-1對(duì)hDPSCs的增殖無(wú)明顯影響，但能明顯促進(jìn)hDPSCs遷移和分化能力。

3 DPSCs的遷移

趨化現(xiàn)象是一種復(fù)雜的生物行為，由趨化因子與受體結(jié)合而啟動(dòng)，同時(shí)伴隨著細(xì)胞骨架的重排。趨化因子是一組能夠誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的分泌蛋白。

在齲病的最后階段，炎癥將會(huì)出現(xiàn)在齲齒下的髓室并誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡，hDPSCs可在一定程度上補(bǔ)救這一過(guò)程[12]。hDPSCs屬于間充質(zhì)干細(xì)胞，表達(dá)一系列趨化因子和附著受體。hDPSCs被表達(dá)在細(xì)胞外基質(zhì)的趨化因子所刺激，此后遷移至受損區(qū)域，在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和修復(fù)性牙質(zhì)形成中起重要作用。

Li 等[12]發(fā)現(xiàn)：SDF-1與其G耦合蛋白受體CXCR4相互作用來(lái)誘導(dǎo)SDF-1/CXCR4信號(hào)；hDPSCs的遷移被SDF-1以濃度依賴方式所誘導(dǎo)，也可以被CXC趨化因子受體4 小干擾RNA(siCXCR4)、細(xì)胞分裂周期42小干擾RNA(siCDC42)和藥物抑制劑[如CXCR4拮抗劑(AMD3100)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑(LY294002)以及黏著斑激酶(FAK)抑制劑(PF573228)]所抑制；限制SDF-1的活性或阻止其與CXCR4的結(jié)合可降低hDPSCs的遷移能力；Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明：SDF-1以劑量依賴方式影響CXCR的表達(dá)；Transwell實(shí)驗(yàn)證明：在下室培養(yǎng)液中隨著SDF-1劑量增加，可見大量hDPSCs遷移至下室。SDF-1/CXCR4軸與FAK、PI3K、GSK3β和β-catenin通路相互作用一同調(diào)控hDPSCs遷移。

Wen 等[11]也發(fā)現(xiàn)：SDF-1對(duì)hDPSCs的增殖無(wú)明顯影響，但對(duì)遷移及成牙本質(zhì)分化的影響較G-CSF明顯。Yang 等[13]通過(guò)體外研究表明：SDF-1可以明顯提高h(yuǎn)DPSCs的遷移，自噬抑制劑明顯抑制hDPSCs的遷移，而自噬激活劑大大增強(qiáng)SDF-1α刺激細(xì)胞遷移的能力。Zeng 等[14]模擬臨床發(fā)現(xiàn)：根管沖洗后釋放出大量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)并非bFGF，TGF-β1釋放到根管內(nèi)能夠誘導(dǎo)hDPSCs的遷移。

4DPSCs的分化

hDPSCs是牙髓未分化的外胚間充質(zhì)細(xì)胞，在不同誘導(dǎo)劑作用下，可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞等多種細(xì)胞[15-16]。Laino 等[17]從34例17～39歲的患者中取出第三磨牙，分離牙髓組織后成功誘導(dǎo)hDPSCs向成骨細(xì)胞分化。Almushayt 等[18]發(fā)現(xiàn):hDPSCs可以向成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化。Zhang 等[19]利用酶消化法分離人第三磨牙內(nèi)牙髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)其生物學(xué)行為證實(shí)其符合hDPSCs特征，且至少能維持其生物學(xué)特性在25代左右；分別用神經(jīng)性、骨性、脂肪性、成纖維性和軟骨性誘導(dǎo)介質(zhì)誘導(dǎo)可定向分化，具有5個(gè)方向的分化潛能。

4.1 炎癥和年齡對(duì)hDPSCs分化的影響 目前臨床上對(duì)于局限性及可逆性牙髓病變多選擇以保存活髓為目的的治療方法，但對(duì)行牙髓切斷術(shù)后切除的炎癥牙髓組織沒(méi)有采取合理的利用。Li 等[20]通過(guò)移植自體來(lái)源發(fā)炎牙髓組織中的干細(xì)胞修復(fù)人牙齒周圍的骨缺損，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組炎癥組織來(lái)源的牙髓干細(xì)胞(DPSCs derived from inflammatory dental pulp tissue，DPSCs-IP)依然保持著成骨、成軟骨和成脂肪分化的潛能，相較于非炎癥組織來(lái)源的牙髓干細(xì)胞(DPSCs derived from normal dental pulp tissue，DPSCs-NP)，成骨分化潛能雖然有輕微的下降，但實(shí)驗(yàn)組成軟骨和成脂肪分化能力無(wú)明顯變化。盡管DPSCs-IP成骨能力有輕微的降低，但是在臨床治療中，DPSCs-IP仍然是DPSCs-NP良好的替代品。Hozhabri 等[21]也發(fā)現(xiàn)：hDPSCs暴露于炎癥介質(zhì)時(shí)，NF-κB的低表達(dá)可以增強(qiáng)其向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的能力以及膠原蛋白的表達(dá)。為探討不同年齡段人體內(nèi)hDPSCs自身分化能力是否相同，Yi 等[22]通過(guò)檢測(cè)青年到老年不同年齡段捐獻(xiàn)者h(yuǎn)DPSCs的分化潛能發(fā)現(xiàn)：來(lái)自青年捐獻(xiàn)者的hDPSCs有著更強(qiáng)的增殖能力以及成骨分化和成脂肪分化能力。hDPSCs的活性受機(jī)體自身牙體狀態(tài)的影響，有炎癥的牙髓組織依然具有一定的利用價(jià)值。

4.2 成骨/成牙本質(zhì)分化能力 hDPSCs在機(jī)體內(nèi)對(duì)修復(fù)受損的牙本質(zhì)起著重要的作用，因此hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化一直是研究的熱點(diǎn)。此外，成牙本質(zhì)細(xì)胞與成骨細(xì)胞有著相似的生理作用，因此對(duì)于hDPSCs向成骨細(xì)胞分化用以治療骨缺損也逐漸引起學(xué)者的關(guān)注。按照不同的誘導(dǎo)分化方式，大致可分為物理誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)和生物誘導(dǎo)等。(1)物理誘導(dǎo)：①低氧環(huán)境。Wu 等[23]觀察經(jīng)過(guò)低氧預(yù)處理的hDPSCs向成骨細(xì)胞分化的能力發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生更多的礦化結(jié)節(jié)；檢測(cè)成骨基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組hDPSCs mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組。說(shuō)明低氧預(yù)處理的hDPSCs能夠明顯增強(qiáng)hDPSCs成骨方向的分化。Werle 等[5]研究表明：在低氧環(huán)境下hDPSCs的分化潛能與旁分泌作用增強(qiáng)有關(guān)。②氧化石墨烯(graphene oxide，GO)培養(yǎng)基。Rosa 等[24]用GO作為培養(yǎng)基檢測(cè)hDPSCs的生物相容性、分化潛能和物理及表面特性，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基支持hDPSCs的黏附和增殖，能夠促進(jìn)其表達(dá)某些礦物質(zhì)基因(MSX-1、PAX-9、RUNX2、COL1、DMP-1以及DSPP)并且表現(xiàn)出良好的生物相容性。該實(shí)驗(yàn)表明：在不使用化學(xué)誘導(dǎo)劑的情況下，GO可以誘導(dǎo)牙源性基因的高表達(dá)，未來(lái)可以著眼于特定種系的研究。③正畸負(fù)荷治療。Yu 等[25]對(duì)大鼠進(jìn)行正畸治療誘導(dǎo)牙齒重建發(fā)現(xiàn)：正畸治療在體內(nèi)通過(guò)活化促炎因子白細(xì)胞介素14-A(Interleukin-14A，IL-14A)改變牙髓微環(huán)境，明顯地促進(jìn)hDPSCs自我更新以及分化的能力；體外模擬體內(nèi)的白細(xì)胞介素17-A(Interleukin-17A，IL-17A)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；通過(guò)油紅O染色、茜素紅染色以及Western blotting分析：實(shí)驗(yàn)組hDPSCs成脂、成骨能力均高于對(duì)照組。該研究結(jié)果表明：正畸治療促進(jìn)hDPSCs 自我復(fù)制以及增強(qiáng)多向分化的能力，尤其是在大鼠正畸負(fù)荷7 d后結(jié)果明顯。(2)化學(xué)誘導(dǎo)：①辛伐他汀。Jia 等[26]研究辛伐他汀在DPSCs增殖、分化方面的作用以及在活髓切斷術(shù)后DPSCs誘導(dǎo)髓室再生的作用，結(jié)果顯示：1 μmol·L-1辛伐他汀抑制犬DPSCs增殖，增加堿性磷酸酶的活性和礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，表明辛伐他汀具有促進(jìn)犬DPSCs成骨/成牙本質(zhì)分化的能力。②生物膜。Soares 等[8]將膠原凝膠與殼聚糖溶液(2∶1)混合，加入活性鋁酸鈣水泥為礦物相的生物膜構(gòu)成實(shí)驗(yàn)組，惰性材料聚苯乙烯構(gòu)成對(duì)照組，將DPSCs接種于2組生物膜表面，檢測(cè)ALP、總蛋白、DMP-1/DSPP基因表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的沉積，結(jié)果顯示：生物膜誘導(dǎo)DPSCs分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞為高度分泌型。③支架材料。Khojasteh 等[9]評(píng)估市場(chǎng)上提供的4種支架材料(SureOss、Cerabone、PLLA 和 OSTEON )對(duì)hDPSCs的黏附性、增殖及分化的影響，結(jié)果顯示：培養(yǎng)14 d后，PLLA和OSTEON支架中的DPSCs與Cerabone支架比較ALP活性明顯升高，3種支架中培養(yǎng)的DPSCs成骨活性比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④胰島素。Lauritano 等[27]證實(shí)胰島素可以影響DPSCs的增殖以及向成骨方向的分化，并將進(jìn)一步探索使用這種新方法進(jìn)行骨組織重建的研究。(3)生物誘導(dǎo)：糖代謝，特別是線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)和糖酵解，在細(xì)胞生命活動(dòng)中起著重要的作用。糖代謝可以被重新編程來(lái)維持干細(xì)胞或誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化，從而調(diào)節(jié)組織修復(fù)和再生。Wang 等[28]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)細(xì)胞在誘導(dǎo)礦化的培養(yǎng)基上開始分化時(shí)，線粒體嵴變得細(xì)長(zhǎng)發(fā)達(dá)，線粒體耗氧率明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為基礎(chǔ)呼吸增加和線粒體ATP的產(chǎn)生，結(jié)果表明糖代謝的重新編程伴隨著DPSCs的分化，可能在牙髓修復(fù)調(diào)控過(guò)程中扮演重要的角色。Wen 等[11]在比較SDF-1與G-CSF對(duì)DPSCs增殖、遷移和分化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：2組DPSCs均有明顯地向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的潛能：表現(xiàn)出較高的ALP活性、較多的礦化結(jié)節(jié)及較多的DMP-1和牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)表達(dá)。

4.3 其他分化方向的能力 Li 等[29]發(fā)現(xiàn)：miR-143和miR-135抑制劑能夠誘導(dǎo)hDPSCs分化為骨骼肌細(xì)胞；從正常成人第三磨牙分離而來(lái)的DPSCs與5-Aza體外培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)其向成肌細(xì)胞分化，結(jié)果顯示：miR-135 和miR-143的表達(dá)在被5-Aza誘導(dǎo)的DPSCs形成的成肌細(xì)胞中明顯減少，部分被miR-143和miR-135抑制劑處理的DPSCs表現(xiàn)出明顯的成肌細(xì)胞特性，共轉(zhuǎn)染miR-143和miR-135抑制因子的DPSCs成骨骼肌分化并分化后的細(xì)胞一半形成肌管。 Kim 等[30]發(fā)現(xiàn)：納米圖案化表面可以通過(guò)改變hDPSCs的外形與基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)其向成脂分化的能力，但同時(shí)抑制成牙本質(zhì)分化的能力。Chen 等[31]證明：從冷凍保存牙髓組織中提取的DPSCs不僅有向肝細(xì)胞樣分化的可行性，而且分化后的細(xì)胞具有正常的核型并且功能接近正常肝樣細(xì)胞。Westin等[32]使用泵(10 mL·min-1)把殼聚糖醋酸溶液加入到pH值為7.7且含有7% poloxamer 188的黃原膠水溶液中，機(jī)械攪拌、烘干消毒后制成支架。將無(wú)菌支架放置于24孔板中，加入含有100 μmoL·L-1kartogenin的成軟骨培養(yǎng)液使之充滿支架內(nèi)部空隙；使用注射器將DPSCs細(xì)胞懸液分4個(gè)不同區(qū)域注入支架內(nèi)部，確保DPSCs充滿整個(gè)支架內(nèi)部孔隙；細(xì)胞在孵箱內(nèi)孵育2 h后分別將2 mL成軟骨培養(yǎng)液加入24孔板內(nèi)防止細(xì)胞分離，培養(yǎng)14 d后分化為軟骨細(xì)胞。

5 問(wèn)題與展望

自2000年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在DPSCs的形態(tài)、生物特性和生物相容性[33-37]等方面進(jìn)行了詳盡的研究，最終取得了顯著的成果。Li 等[38]認(rèn)為：hDPSCs是一種很有前途的自體骨組織工程種子細(xì)胞并且目前已有臨床應(yīng)用的案例。DPSCs在骨組織工程學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段，但向其他組織分化的研究仍在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。此外，DPSCs在臨床上獲取數(shù)量有限，用于臨床治療缺乏長(zhǎng)期跟蹤報(bào)道，以上問(wèn)題制約了DPSCs在臨床上應(yīng)用。未來(lái)的研究應(yīng)著眼于找尋DPSCs更具特異性的標(biāo)記物，對(duì)于DPSCs的培養(yǎng)方法也應(yīng)施行國(guó)際化規(guī)范，以便于確定其增殖和分化的程度。