活性氧對高原性肺動脈高壓的影響

張國振 綜述 何慶,2 審校

(1.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610036； 2.西南交通大學(xué)附屬成都市第三人民醫(yī)院，四川 成都 610036)

肺動脈壓力≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)稱之為肺動脈高壓(HPH)，高原上低氧誘導(dǎo)的HPH發(fā)生概率遠(yuǎn)大于其他HPH，長期的HPH也會引起肺水腫、右心室衰竭甚至死亡等嚴(yán)重后果。肺血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)、肺血管結(jié)構(gòu)重建、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞對肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)運(yùn)動和生長狀態(tài)調(diào)制的異常，則是HPH變化特征的重要成因之一。近年來揭示這種復(fù)雜的病變可能包括多種細(xì)胞類型，包括內(nèi)皮細(xì)胞、PASMCs等，它們在體內(nèi)作為重要的調(diào)節(jié)組織維持著肺動脈壓的穩(wěn)態(tài)。而活性氧(ROS)也同時參與了內(nèi)皮細(xì)胞和PASMCs對于肺動脈壓的調(diào)控。有證據(jù)表明，高原環(huán)境下帶來的低氧誘導(dǎo)了ROS的過載[1]，過載的ROS通過改變肺血管細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑來促成HPH[2]。目前研究表明ROS過載的主要來源為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH氧化酶，即NOX)和/或線粒體?，F(xiàn)簡要綜述ROS參與肺動脈壓調(diào)控的主要方式及作用機(jī)制。

1 ROS的定義和生理功能

氧在生物體內(nèi)通過單電子還原產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì)稱ROS，它們包括超氧負(fù)離子自由基、過氧化氫和羥基自由基，它們一旦產(chǎn)生，可以相互轉(zhuǎn)化，發(fā)生連鎖反應(yīng)。存在于生物體內(nèi)活躍的ROS可用電子自旋共振儀測定。在生理情況下，ROS的生成與清除處于動態(tài)平衡，ROS可維持于有利無害的極低水平。由于內(nèi)源性和/或外源性刺激使機(jī)體代謝異常而驟然產(chǎn)生大量ROS，或機(jī)體抗氧化物質(zhì)不足從而使得促氧化劑/抗氧化劑間平衡失常，則使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，可氧化損傷生物分子，并進(jìn)一步引起細(xì)胞死亡和組織損傷。同時ROS可作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在細(xì)胞基因調(diào)控、細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的生理功能。ROS通過影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)磷酸化和信號的級聯(lián)傳遞、轉(zhuǎn)錄因子的激活等細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中的多個靶位點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞信號的傳導(dǎo)，產(chǎn)生細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，如參與細(xì)胞生長、凋亡。

2 ROS的來源

目前普遍的看法是ROS大多來源于NADPH氧化酶和/或線粒體，包括過量的ROS可以迅速提高線粒體內(nèi)膜的滲透性，即線粒體的滲透性過度，從而導(dǎo)致線粒體潛在的去極化[3]；但確切的氧感應(yīng)機(jī)制以及ROS是否引起低氧性肺血管收縮(HPV)增加或減少的問題正在爭論中。ROS可通過與蛋白激酶、磷脂酶、肌質(zhì)鈣通道、瞬時受體電位通道、電壓依賴性鉀通道和L-型鈣通道的直接或間接相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣增加和隨后的PASMCs收縮，其相關(guān)性可能在不同實(shí)驗(yàn)中并不完全一樣[4]。

NOX(即NADPH氧化酶)是通過將電子從NADPH轉(zhuǎn)移至分子氧，快速轉(zhuǎn)化為過氧化氫的一組超氧陰離子生成酶。NOX家族有7個成員，包括NOX1～NOX5、雙氧化酶1和雙氧化酶2。最近的研究表明，NOX亞型在不同類型的HPH中可能具有不同的功能。評估來自HPH和非HPH患者和缺氧暴露的人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的肺組織標(biāo)本的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。使用細(xì)胞色素和熒光試劑測定來測量ROS。研究結(jié)果首次證實(shí)，與非HPH患者相比，HPH耐藥血管中轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的NOX1表達(dá)上調(diào)[5]。然而在從SD大鼠的外周血中分離內(nèi)皮祖細(xì)胞并使其經(jīng)受缺氧(氧氣含量與氮?dú)夂颗c二氧化碳含量比值為1∶94∶5)24 h試驗(yàn)中表明，低氧處理促進(jìn)了內(nèi)皮祖細(xì)胞的衰老和凋亡，伴隨著內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能降低(黏附、遷移和血管生成能力下降)，以及NOX2和NOX4表達(dá)的增加，NOX活性的增強(qiáng)和過氧化氫產(chǎn)生的增加，這些現(xiàn)象被NOX抑制劑減弱[6]。雖然目前無法確切了解NOX與ROS相關(guān)的家族成員，但其衍生的ROS是參與促進(jìn)肺血管重構(gòu)過程的關(guān)鍵因素。

另外一種觀點(diǎn)是線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)荝OS的主要來源，線粒體ROS可以特異性地增加蛋白激酶C-ε的活性，激活NOX，然后誘導(dǎo)更多的ROS產(chǎn)生(即ROS誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生)。線粒體ROS產(chǎn)生主要由復(fù)合物Ⅲ中的Rieske鐵硫蛋白介導(dǎo)[7]。也有研究表明：線粒體電子傳遞鏈的復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ處氧感應(yīng)的發(fā)生增加了肺動脈PASMCs中ROS的產(chǎn)生[8]。有人提出，在新生兒的PASMC中，缺氧抑制ROS的產(chǎn)生并減少氧化還原對的生成，從而抑制氧敏感的電壓門控鉀通道、去極化質(zhì)膜、激活電壓門控鈣通道，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，并引起血管收縮[9]。然而大多數(shù)人還是認(rèn)為ROS的增加引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而導(dǎo)致HPV和相關(guān)的HPH。

3 ROS過載引發(fā)HPH的機(jī)制

目前研究ROS的過載主要還是基于上述的兩個觀點(diǎn)，由于低氧誘導(dǎo)增強(qiáng)了ROS的分泌來源，引起了HPH。Chandel等首先證明了線粒體ROS信號在缺氧條件下控制基因轉(zhuǎn)錄，隨著科學(xué)研究的發(fā)展，各項(xiàng)假說與實(shí)驗(yàn)不斷完善低氧誘導(dǎo)下ROS增加的相關(guān)機(jī)制，接下來將簡述最新的一些假說及其證據(jù)。

Weise-Cross等[10]提出的假說是：慢性低氧通過ROS生成和RhoA/Rho激酶(ROCK)至依賴性肌絲Ca2+致敏增強(qiáng)基礎(chǔ)和內(nèi)皮素-1(ET-1)誘導(dǎo)的肺血管收縮反應(yīng)。為了測試慢性低氧是否直接改變動脈肌動蛋白譜，通過熒光標(biāo)記固定肺動脈中的F-肌動蛋白和G-肌動蛋白以及通過肌動蛋白沉降測定肺動脈溶解產(chǎn)物來測量絲狀(F)和球狀(G)肌動蛋白比率。通過免疫印跡最終得出結(jié)論：肌動蛋白聚合有助于以ROS-、ROCK-依賴性方式增加慢性低氧后的基礎(chǔ)肺動脈收縮和ET-1誘導(dǎo)的血管收縮的反應(yīng)性。肌動蛋白解聚因子絲切蛋白家族是一類肌動蛋白結(jié)合蛋白，廣泛存在于真核細(xì)胞體內(nèi)。慢性低氧后增強(qiáng)的ET-1介導(dǎo)的肌動蛋白聚合依賴于mDia(RhoA效應(yīng)物)，但與磷酸化絲切蛋白/總肌動蛋白解聚因子絲切蛋白的比值變化無關(guān)。

Wu等[11]認(rèn)為ROS、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)和鉀通道(Kv)被認(rèn)為是HPH發(fā)展過程中的主要因素，他們提出“ROS/Kv/HIF軸”可能在HPH的發(fā)展中起到重要的啟動作用，ROS在低氧條件下形成，影響HIF或Kv的表達(dá)和功能，并因此觸發(fā)多個參與促進(jìn)肺血管收縮和動脈重構(gòu)的下游信號傳導(dǎo)途徑和基因表達(dá)。首先，缺氧導(dǎo)致肺內(nèi)小動脈ROS的劇增。增加的ROS會抑制Kv在肺動脈的活動，同時ROS也會抑制脯氨酸羥化酶的生成穩(wěn)定HIF活動。Kv活性降低可以解釋缺氧暴露下早期的肺血管收縮反應(yīng)。另一方面，穩(wěn)定的HIF軸可以激活其下游基因，進(jìn)而引起HPH中參與肺血管重構(gòu)的各種缺氧相關(guān)蛋白的表達(dá)。上述這些因素進(jìn)一步導(dǎo)致了肺血管收縮/擴(kuò)張和增殖/凋亡的不平衡，最終促進(jìn)了HPH的發(fā)展。

最后還有陰離子交換學(xué)說，Mansoori等[12]認(rèn)為細(xì)胞膜中沒有超氧陰離子的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它可能通過陰離子交換劑從細(xì)胞中釋放出來；因此，通過家兔實(shí)驗(yàn)研究ROS和陰離子交換劑在急性HPV中的相互作用，通過灌流液處理分離的兔肺，最終Trolox(抗氧化劑)和Trolox+DIDS(陰離子交換劑抑制劑)組都消除了HPV。 Trolox+DIDS組的NO代謝物濃度高于其他組。表明急性HPV中ROS和陰離子交換劑之間可能存在相互作用。這也提示了NO在上述條件下的調(diào)節(jié)作用。然而在Jernigan等[13]操作的大鼠肺動脈的抗氧化治療模型中。研究結(jié)果雖然支持ROS在介導(dǎo)血管收縮反應(yīng)性增強(qiáng)和HPH中的主要作用，然而在慢性缺氧的大鼠模型中，抗氧化劑療法在缺氧時嚴(yán)重HPH動物中加重動脈重構(gòu)。同樣的，在Chen等[3]關(guān)于肺動脈PASMCs特異性凋亡是否參與了復(fù)氧誘導(dǎo)的低氧性肺動脈重構(gòu)逆轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)體外實(shí)驗(yàn)下重建肺動脈的逆轉(zhuǎn)與過氧化氫增加和標(biāo)本切割的caspase 3/PARP、Bax和Bcl-2的改變相關(guān)，復(fù)氧可誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠初代PASMCs凋亡，伴隨著線粒體ROS增加，線粒體功能障礙以及細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)。ROS的清除減輕了線粒體功能障礙以及細(xì)胞色素C的釋放，并最終降低了PASMC凋亡。即復(fù)氧誘導(dǎo)的PASMCs凋亡與缺氧性肺動脈重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)有關(guān)，這可能與線粒體ROS介導(dǎo)的線粒體功能障礙有關(guān)。是否可以猜想，非嚴(yán)重的HPH可能存在緩解甚至是逆轉(zhuǎn)重構(gòu)的可能，然而嚴(yán)重的HPH經(jīng)過抗氧化治療后情況反而會加重，這其中的機(jī)制還有待發(fā)現(xiàn)和進(jìn)一步闡明。

之前還有研究表明ROS是第二信使分子，其通過可逆地氧化關(guān)鍵靶蛋白的特定氨基酸殘基來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[14]。主要表現(xiàn)血管平滑肌對G蛋白偶聯(lián)受體刺激的收縮反應(yīng)以及肺動脈中的缺氧顯示出依賴于ROS和Src家族激酶活性。影響活性的特定磷酸化靶點(diǎn)由于細(xì)胞內(nèi)變化的Ca2+濃度被識別。，而Ca2+濃度的調(diào)節(jié)主要受到的影響包括瞬時受體電位通道、電壓門控通道和各種類型的K+通道，以及那些調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架動力學(xué)和肌球蛋白磷酸酶活性，包括黏著斑激酶、蛋白酪氨酸激酶-2、Janus激酶，其他黏著相關(guān)蛋白和Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子。

4 觸發(fā)ROS增加的相關(guān)小分子

至今，ROS的研究已證實(shí)了與ROS相關(guān)的細(xì)胞分子和基因包括：線粒體氧化還原調(diào)節(jié)劑硫氧還蛋白2、氧化低密度脂蛋白受體-1以及DRP1(GTP酶)。在這些分子中，硫氧還蛋白2的體外過表達(dá)減少了低氧誘導(dǎo)的過氧化氫的產(chǎn)生[2]。Zhu等[15]發(fā)現(xiàn)缺氧引起大鼠右心室和心肌細(xì)胞(H9C2細(xì)胞)中的顯著氧化應(yīng)激，減少氧化低密度脂蛋白受體-1可以顯著減弱H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激。Zhang等[16]觀察到缺氧誘導(dǎo)的DRP1表達(dá)依賴于ROS產(chǎn)生，特別是線粒體ROS。此外，低氧引起的ROS和線粒體ROS水平受DRP1調(diào)節(jié)。

5 討論

目前認(rèn)為缺氧誘導(dǎo)下線粒體和NADPH造成了ROS的增加影響著HPH，事實(shí)上，并不排除其他來源的可能性。目前關(guān)于ROS的相關(guān)機(jī)制很多尚不清晰，盡管很多研究做出了ROS相關(guān)的散在影響分子，這些分子以直接或間接的形式對ROS造成影響，甚至引起了基因表達(dá)的改變，卻無證據(jù)表明直接與ROS相關(guān)。目前認(rèn)為ROS參與低氧誘導(dǎo)HPH主要是：慢性低氧通過ROS生成和ROCK至依賴性肌絲Ca2+致敏增強(qiáng)基礎(chǔ)和ET-1誘導(dǎo)的肺血管收縮反應(yīng)假說，“ROS/Kv/HIF軸”假說以及可能的陰離子交換學(xué)說。雖然其中關(guān)于ROS的作用闡述得較為系統(tǒng)全面，但可能并不完全，仍需進(jìn)一步研究。