EGFR的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

閆會(huì)杰，王繼紅

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081)

上皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種分子量為1.7×106的跨膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶受體，是ErbB家族信號(hào)受體的成員之一。EGFR也被稱作HER1、ErbB1，主要分布在細(xì)胞膜表面，由胞外配體結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域3部分組成。EGFR能夠參與多種信號(hào)通路，在生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用，它的過表達(dá)或突變通常會(huì)引發(fā)機(jī)體癌變。當(dāng)EGFR通過內(nèi)吞內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后，則會(huì)阻礙信號(hào)通路的傳遞。有研究發(fā)現(xiàn)在EGFR無法發(fā)生內(nèi)吞的細(xì)胞中，上皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)的刺激能夠增強(qiáng)有絲分裂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖[1]，這也證明了EGFR的內(nèi)吞與其信號(hào)傳導(dǎo)之間確實(shí)存在著某種聯(lián)系。而本文關(guān)注的焦點(diǎn)在于EGFR內(nèi)吞的不同轉(zhuǎn)運(yùn)途徑及其涉及到的分子機(jī)制。

1 EGFR的內(nèi)化

EGFR通常與配體結(jié)合發(fā)生活化，通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的途徑和不依賴網(wǎng)格蛋白途徑的多種途徑進(jìn)行內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了EGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-α，TGF-α)、肝素結(jié)合EGF樣生長(zhǎng)因子(heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF)、β細(xì)胞因子(betacelluin，BTC)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin，AR)、上皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin,EPI)、epigen和neuregulin2-β等8種EGFR配體[2]。EGFR與配體結(jié)合后，其胞外結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致EGFR二聚化并使其活化[3]。有研究發(fā)現(xiàn)未結(jié)合配體的EGFR也可以發(fā)生內(nèi)化，但其內(nèi)化速率明顯要慢于結(jié)合了配體的EGFR[4]。在不結(jié)合配體的情況下，EGFR也會(huì)表現(xiàn)出在單體和二聚體之間波動(dòng)，但結(jié)合配體似乎是EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的必需條件[5]。

2 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑

網(wǎng)格蛋白(clathrin)是具有3條重鏈的三聚體，主要參與質(zhì)膜的內(nèi)吞[6]。有研究表明，干擾網(wǎng)格蛋白的重鏈能夠抑制EGFR的內(nèi)吞[7-8]。因此EGFR的主要內(nèi)化途徑可能是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑(clathrin-mediated endocytosis,CME)。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)EGF處于低濃度時(shí)能夠觀察到CME特征的高內(nèi)化率，而EGF的攝取率會(huì)隨著EGF濃度的增加而降低[9]。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明EGFR的內(nèi)化速率也會(huì)依賴EGF的濃度，同時(shí)在這個(gè)過程中也可能會(huì)出現(xiàn)飽和的情況，又或者是由于細(xì)胞表面存在過多的復(fù)合物限制了CME對(duì)EGF的攝取[10]。還有研究稱EGFR的內(nèi)吞過程中網(wǎng)格蛋白銜接蛋白復(fù)合物(adapter protein-2,AP-2)也參與其中，但由于siRNA沉默AP-2的表達(dá)后并沒有影響EGFR內(nèi)化，因此AP-2的作用仍有爭(zhēng)議[7,11]。已經(jīng)證實(shí)EGFR和AP-2的μ2亞基之間存在相互作用[12]。而EGF刺激后，AP-2的β2亞基發(fā)生的酪氨酸磷酸化與EGFR羧基末端的di-亮氨酸模體有關(guān)[13]。然而該模體的突變只破壞了EGFR的靶向降解，卻并不影響EGFR的內(nèi)吞作用。這表明EGFR di-亮氨酸模體或AP-2的β2磷酸化可能與促進(jìn)下游分選機(jī)制的招募有關(guān)。上述研究表明雖然EGFR的內(nèi)吞過程中并不一定需要AP-2的參與，但它與EGFR的相互作用以及對(duì)內(nèi)吞過程中的其他成分的招募可以促進(jìn)內(nèi)吞作用。

3 非依賴網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞途徑

雖然CME是EGFR內(nèi)吞最主要也是最高效的途徑，但也存在較慢且不依賴網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞途徑。

高濃度的EGF以依賴Epsin和Eps15的方式促進(jìn)EGFR通過非依賴網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞途徑(clathrin-independent endocytosis,CIE)內(nèi)化[14-15]，這種現(xiàn)象的發(fā)生可能與CME達(dá)到飽和有關(guān)。有研究用EGF處理A431細(xì)胞后導(dǎo)致質(zhì)膜出現(xiàn)了大范圍的褶皺，同時(shí)在形成的微胞飲和巨胞飲囊泡中發(fā)現(xiàn)了標(biāo)記的EGF，而在這一過程中并沒有檢測(cè)到網(wǎng)格蛋白外殼[16]。這種EGF誘導(dǎo)的胞飲作用也可能由于A431細(xì)胞中EGFR的高水平表達(dá)。但在隨后用高濃度EGF處理EGFR低表達(dá)的COS細(xì)胞時(shí)，也觀察到了缺乏網(wǎng)格蛋白參與的EGFR內(nèi)化[17]。

EGF-EGFR復(fù)合物的內(nèi)吞作用還涉及到脂筏和胞膜窖(caveolae)[18]。胞膜窖作為質(zhì)膜上的獨(dú)立結(jié)構(gòu)，參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞膜組裝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤生成等多種細(xì)胞活動(dòng)。在海拉細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大部分的EGFR被EGF占據(jù)時(shí)，可以觀察到依賴脂筏的內(nèi)化方式；然而用菲律賓素(filipin)處理海拉細(xì)胞后并不影響EGFR的內(nèi)化[2]。用EGF刺激海拉細(xì)胞后，EGFR可以與窖蛋白發(fā)生共定位，這些結(jié)果表明EGFR的內(nèi)化還可能存在依賴脂筏和窖蛋白的途徑。然而后來有研究用siRNA沉默窖蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并不影響EGFR的內(nèi)化[2]。因此，EGFR依賴胞膜窖和脂筏的內(nèi)吞途徑可能存在細(xì)胞特異性，甚至在海拉細(xì)胞的不同亞克隆中都存在不同的影響。

生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2,Grb2)即ASH蛋白，其結(jié)構(gòu)具有一個(gè)SH2和兩個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種受體激活的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Grb2通過其SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合并活化EGFR[18]。Cbl是主要的與Grb2相互作用的蛋白之一，參與和調(diào)控了EGFR的內(nèi)化和降解[16]。Cbl家族有3個(gè)成員，c-Cbl、Cbl-b、Cbl-3。前兩種具有延伸的C末端，其上具有能與SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的富脯氨酸模體[19]。Cbl作為泛素連接酶，能夠直接或間接地與活化的EGFR結(jié)合并使其泛素化，從而調(diào)節(jié)受體在溶酶體中的靶向降解。不同的細(xì)胞類型中，Cbl與EGFR的相互作用可能具有不同的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)用EGF刺激后在網(wǎng)格蛋白的被膜小窩中檢測(cè)到c-Cbl的存在[20]。而在海拉細(xì)胞、PAE和NIH 3T3細(xì)胞(表達(dá)內(nèi)源性EGFR)中也發(fā)現(xiàn)c-Cbl的突變抑制了EGFR的內(nèi)化[21-22]。與此一致的是在Grb2缺陷的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)c-Cbl與Grb2的SH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能夠緩解EGFR的內(nèi)化[23]，而當(dāng)用siRNA沉默c-Cbl和Cbl-b后，EGFR的內(nèi)化被部分抑制[24]。

Cbl與EGFR第1045位磷酸化的酪氨酸的直接結(jié)合似乎沒有在EGFR的內(nèi)化中表現(xiàn)出重要作用，而Grb2介導(dǎo)的與EGFR的相互作用才是關(guān)鍵[22]。有研究發(fā)現(xiàn)在PAE和海拉細(xì)胞中，利用siRNA沉默Grb2后抑制了EGFR的內(nèi)化[25]。這表明Grb2可能在EGFR內(nèi)化中起著重要作用。此外，在被膜小窩中也發(fā)現(xiàn)了Grb2-EGFR的復(fù)合物，這似乎也進(jìn)一步說明了Grb2對(duì)EGFR內(nèi)化的重要性。例如，在L929細(xì)胞中，Grb2的沉默使得EGFR的內(nèi)化率顯著降低[16]。

值得注意的是，網(wǎng)格蛋白的敲除并不能完全抑制HB-EGF和BTC誘導(dǎo)的EGFR內(nèi)化，這表明HB-EGF和BTC刺激可能是通過其他非網(wǎng)格蛋白依賴的途徑誘導(dǎo)內(nèi)化的[2]。但在單獨(dú)的研究中發(fā)現(xiàn)，即使在高濃度配體的作用下，網(wǎng)格蛋白的消耗也會(huì)對(duì)EGFR的內(nèi)吞存在抑制作用。這表明CIE對(duì)EGFR內(nèi)吞作用的影響較弱[16]?？偨Y(jié)來說，EGFR的內(nèi)化涉及多種因素的組合，是冗余和協(xié)同的。

4 內(nèi)吞后的EGFR分選

EGF與EGFR結(jié)合形成復(fù)合物后進(jìn)入囊泡，含有復(fù)合物的囊泡會(huì)釋放外殼與早期內(nèi)體分開，EGF-EGFR復(fù)合物會(huì)在短時(shí)間內(nèi)積累到早期內(nèi)體并伴隨著內(nèi)體成熟分選到溶酶體或質(zhì)膜。

EGFR進(jìn)入內(nèi)體后靶向溶酶體降解或者循環(huán)到細(xì)胞表面重新利用。這兩條途徑的進(jìn)行微妙平衡了EGFR靶向溶酶體的降解途徑過程中衰減的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和EGFR再循環(huán)回到細(xì)胞表面過程中的持續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

4.1 EGFR泛素化和內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體介導(dǎo)的分選

泛素化修飾對(duì)分選活化的EGFR起著重要作用[26]。泛素化的EGFR被包括內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體-0(endosomal sorting complex required for transport 0,ESCRT-0)組分的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物(Hepatocyte growth factor-regu-lated tyrosine kinase substrate,Hrs)、ESCRT-Ⅰ組分的腫瘤易感基因101(Tsg101)在內(nèi)的泛素相互作用模體(ubiquitin interacting motif,UIM)識(shí)別，然后通過ESCRT機(jī)制分選到成熟內(nèi)體的內(nèi)腔囊泡(intraluminal vesicles,ILVs)上，去除活性激酶結(jié)構(gòu)域，靶向溶酶體進(jìn)行降解。在EGF-EGFR復(fù)合物分選到ILVs前，去泛素化酶(ubiquitin-binding domains,DUB)去除其結(jié)合的泛素，而解離下來的泛素被循環(huán)利用以維持游離的泛素量。泛素化的EGFR與含有Hrs和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)銜接分子(signal-transducing adapter molecules,STAM)的ESCRT-0復(fù)合物存在相互作用。ESCRT-0復(fù)合物通過Hrs與PI3K的相互作用招募泛素化的EGFR聚集到內(nèi)體，同時(shí)ESCRT-0復(fù)合物的Hrs結(jié)構(gòu)通過與ESCRT-I的Tsg101相互作用對(duì)ESCRT-I進(jìn)行招募，ESCRT-I招募的ESCRT-Ⅱ可以激活ESCRT-Ⅲ復(fù)合物，依賴ESCRT-Ⅲ完成ILVs的分離和形成[1]。

4.2 調(diào)節(jié)EGFR回收循環(huán)

現(xiàn)已證實(shí)了泛素化的EGFR在靶向降解中的重要作用，但泛素化的EGFR突變體也被發(fā)現(xiàn)可以逃脫溶酶體的靶向降解，循環(huán)回到質(zhì)膜表面被重新利用[27]。由此看來EGFR的回收循環(huán)似乎是其逃脫靶向降解后的唯一去向，而其相關(guān)效應(yīng)物的確定也表明了這一觀點(diǎn)。EGFR循環(huán)可以通過Rab4和Rab35的直接調(diào)節(jié)或依賴Rab11經(jīng)由核周內(nèi)吞回收室(Endocytic recycling compartment,ERC)的途徑回到質(zhì)膜。同時(shí)還有報(bào)道稱鈣調(diào)蛋白親環(huán)蛋白配體(calcium-modulating cyclophilin ligand,CAML)與激活的EGFR激酶結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)，促進(jìn)EGF刺激的EGFR回收循環(huán)[28]。

影響EGFR內(nèi)吞途徑的其他因素還包括Hrs磷酸化和受體AMSH介導(dǎo)的去泛素化，并且Hrs磷酸化和AMSH失活與EGFR再循環(huán)相關(guān)[29]。此外，配體的激活也可以引導(dǎo)EGFR的轉(zhuǎn)運(yùn)，這取決于配體-EGFR之間相互作用的穩(wěn)定性[1]。例如，EGF與EGFR結(jié)合，通過內(nèi)吞途徑內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)早期內(nèi)體和晚期內(nèi)體完成信號(hào)傳遞后，通常靶向溶酶體降解或是再循環(huán)回到細(xì)胞表面再利用。而TGF-α與EGFR結(jié)合形成的復(fù)合物內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后，配體受到pH下降的影響與EGFR解離，隨后絕大部分EGFR循環(huán)回到細(xì)胞表面。配體HB-EGF和BTC的刺激會(huì)使內(nèi)吞過程中的多數(shù)EGFR降解；配體AR刺激的內(nèi)吞途徑可能進(jìn)入再循環(huán)途徑，EGFR不容易回到細(xì)胞表面[2]。此外，EGFR不同的二聚體也會(huì)產(chǎn)生不同的影響。除同型二聚體外，EGFR還可與ErbB家族成員形成異源二聚體。而在EGF刺激下，EGFR同源二聚體被分選到溶酶體進(jìn)行降解，異源二聚體不能招募Cbl，從而逃脫靶向降解，進(jìn)行回收利用。

5 EGFR內(nèi)化與腫瘤發(fā)生發(fā)展

EGFR的異常表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。EGFR的過表達(dá)和特異性致癌突變導(dǎo)致受體自發(fā)二聚化，引起受體的活化[30]。已經(jīng)在腫瘤中發(fā)現(xiàn)縮短的EGFR突變體和激酶結(jié)構(gòu)域突變的EGFR突變體是EGFR突變的兩種主要類型,兩者都具有持續(xù)的活性[31]。在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)，具有持續(xù)活性的EGFR致癌突變體轉(zhuǎn)運(yùn)到ERC，與src具有高親和性[32]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)這兩種激酶能夠一同轉(zhuǎn)運(yùn)，并且它們的共定位促進(jìn)了EGFR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[33]。然而非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的EGFR突變體似乎在與Cbl的相互作用中受損，致使其發(fā)生去泛素化和降解，導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)延長(zhǎng)[34]。除此之外，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma)細(xì)胞中最常見的EGFR Ⅷ型突變體，其胞外結(jié)構(gòu)域缺失了267個(gè)氨基酸，雖然不能結(jié)合配體，但仍具有活性[35]。

某些致癌基因通過調(diào)節(jié)EGFR轉(zhuǎn)運(yùn)來行使其功能。鳥嘌呤核苷酸交換因子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、遷移和增殖，以延長(zhǎng)生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)、延緩EGFR內(nèi)化和降解，同時(shí)增強(qiáng)EGFR、ERK和AKT磷酸化水平[36]?；罨腃dc42結(jié)合蛋白激酶1(activited Cdc42 kinase 1,ACK1)是一種非酪氨酸激酶，作為細(xì)胞分裂周期蛋白2下游的效應(yīng)器參與了多條信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，在增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[37]。ACK1與泛素化的EGFR相互作用，促進(jìn)EGFR降解，通過涉及Arp2/3調(diào)節(jié)蛋白、皮層蛋白磷酸化的機(jī)制，潛在的提供了Arp2/3為基礎(chǔ)的肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)和EGFR靶向溶酶體的一種聯(lián)系[38]。

6 展 望

EGFR與配體(以EGF為主)結(jié)合發(fā)生活化，通過CME和CIE途徑進(jìn)入細(xì)胞并轉(zhuǎn)運(yùn)到早期內(nèi)體和晚期內(nèi)體，經(jīng)ILVs和ESCRT機(jī)制分選后靶向溶酶體降解或循環(huán)回到質(zhì)膜表面重新利用?？傊?，EGFR的內(nèi)化過程十分復(fù)雜，它依賴于多種冗余機(jī)制[16]。通過對(duì)EGFR內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的了解，不僅增加了我們對(duì)EGFR與腫瘤發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)，并且還可以從中找到新的治療靶點(diǎn)。然而這其中仍有問題需要我們深入研究，例如越來越多的證據(jù)表明放化療反應(yīng)中，調(diào)控EGFR轉(zhuǎn)運(yùn)可增強(qiáng)常規(guī)放化療耐藥腫瘤的治療效果，而EGFR的信號(hào)傳導(dǎo)似乎也對(duì)細(xì)胞存活和DNA修復(fù)起著重要作用。未來隨著對(duì)EGFR內(nèi)化途徑及內(nèi)吞后的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)機(jī)制研究的深入，應(yīng)激激活的EGFR轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制的確定將有助于分析EGFR轉(zhuǎn)運(yùn)在調(diào)節(jié)DNA修復(fù)和細(xì)胞存活中的重要性，并以此開發(fā)出新的針對(duì)誘導(dǎo)EGFR內(nèi)化或胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)的藥物治療癌癥。