反相高效液相色譜法測定防己黃芪湯中6種活性成分的含量

關 皎，張 穎，費 雪，孫宇慧，王黎明，郝乘儀，馮 波，朱鶴云

(吉林醫(yī)藥學院藥學院,吉林 吉林 132013)

防己黃芪湯出自漢代張仲景所著的《金匱要略》，原文記載“風濕，脈浮身重，汗出惡風者，防己黃芪湯主之；風水，脈浮身重，汗出惡風者，防己黃芪湯主之”[1]。該方由防己、黃芪、白術、甘草組成，在臨床應用中常加入生姜和大棗，具有益氣祛風、健脾利水的功效。研究表明，防己黃芪湯具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、利尿、降血脂等多種生物活性，廣泛用于關節(jié)炎癥、水腫、腎臟疾病和肺部疾病的治療[2-4]。

防己黃芪湯的配方體現(xiàn)“治水必治氣，氣行則水行，氣伏則水伏”的思想，方中防己、黃芪共為君藥，白術為臣藥，甘草、生姜、大棗共為佐使藥。防己配伍白術祛風利水除濕，配伍黃芪益氣固表補虛；防己得黃芪可加強利水濕之功，黃芪得白術增益氣之力；甘草、生姜、大棗調(diào)和營衛(wèi)，助力黃芪益氣固表之效[5]。防己中主要含有粉防己堿和防己諾林堿等生物堿類成分，具有祛風濕、止痛、利水消腫等功效[6]；黃芪中主要含有毛蕊異黃酮等黃酮類成分和黃芪甲苷等皂苷類成分，具有增強免疫力、促進血液循環(huán)等功效[7]；白術中主要含有白術內(nèi)酯Ⅰ等內(nèi)酯類成分，具有健脾益氣、調(diào)節(jié)胃腸運動、抗炎等功效[8]；甘草中主要含有甘草酸等三萜類成分和甘草苷等黃酮類成分，具有抗炎、抗?jié)?、抗過敏等功效[9]。目前，針對防己黃芪湯組方中各單味藥的質(zhì)量控制已有大量文獻報道[10-14]，但關于防己黃芪湯質(zhì)量控制的報道較少[15-16]，而且這些方法存在分析時間較長、檢測指標少、樣品處理復雜等缺點。本研究采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法在同一流動相下采用兩種洗脫方法測定防己黃芪湯中的6種活性成分(粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白術內(nèi)酯Ⅰ)的含量，為全面評價防己黃芪湯的內(nèi)在質(zhì)量提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20A型高效液相色譜儀(配備Prominence SIL-20AHT自動進樣器，LC-20AT二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-20A紫外檢測器，LC solution色譜工作站，日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA 225D型電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)；FW80微型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；98-1-C型數(shù)字控溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；XK96-A快速混勻器(江蘇新康醫(yī)藥器械有限公司)。

乙腈和甲醇為色譜純(美國Fisher科技)，甲酸和醋酸銨為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)，所用水為經(jīng)過Milli-Q型超純水儀凈化后的超純水，其他試劑均為分析純。對照品粉防己堿(批號：110711-201609)、防己諾林堿(批號：110793-201606)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號：111920-201606)、甘草苷(批號：111610-201607)購自中國食品藥品檢定研究院，對照品甘草酸(批號：151014)和白術內(nèi)酯Ⅰ(批號：160321)購自成都普菲德生物技術有限公司，純度均大于98%。

粉防己、黃芪、白術、炙甘草、大棗、生姜分別購自吉林市吉林大藥房，產(chǎn)地分別為江西、甘肅、浙江、內(nèi)蒙、新疆、吉林，經(jīng)吉林醫(yī)藥學院生藥教研室李景華副教授鑒定為防己科植物粉防己StephaniatetrandraS.Moore的干燥根，豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖的炮制品，鼠李科植物棗ZiziphusJujubaMill.的干燥成熟果實，姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的新鮮根莖。樣本留存于吉林醫(yī)藥學院藥學院中藥樣品室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18(2)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相為0.2 mol/L乙酸銨0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。

測定粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸時采用梯度洗脫(0～5 min，15%～20%B；5～10 min，20%～30%B；10～15 min，30%～35%B；15～20 min，35%～45%B，V/V)；檢測波長為254 nm。典型色譜圖見圖1。測定白術內(nèi)酯Ⅰ時采用等度洗脫(0～8 min，80%～80%B，V/V)，檢測波長為220 nm。典型色譜圖見圖2。

2.2 防己黃芪湯的制備

參照《金匱要略》原文，折合成現(xiàn)代劑量，分別稱取防己12 g、黃芪15 g、白術9 g、炙甘草6 g，加入生姜4片和大棗1枚，置于1 L圓底燒瓶中，加入10倍量水浸泡0.5 h，回流提取1 h，放冷過濾，濾渣再加入10倍量的水回流提取1 h，放冷過濾。最后合并2次濾液，濃縮至50 mL，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 溶液的制備

2.3.1對照品溶液的制備

取粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸對照品適量，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，制成含粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸均為1.0 g/L的單一對照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ“仔g內(nèi)酯Ⅰ對照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，制成含白術內(nèi)酯Ⅰ為0.1 g/L的對照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2供試品溶液的制備

取“2.2”項下防己黃芪湯提取液1 mL，置50 mL錐形瓶中，加70%甲醇溶液25 mL，稱重，超聲提取30 min，放冷后再稱重，用70%甲醇補足缺失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.3.3陰性樣品溶液的制備

按處方量分別制備不含防己的陰性樣品溶液、不含黃芪的陰性樣品溶液、不含甘草的陰性樣品溶液和不含白術的陰性樣品溶液，按“2.3.2”項方法操作，即得。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.3.1”項下粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸對照品溶液適量，置于5 mL量瓶中，用甲醇-水(70∶30,V/V)配制成粉防己堿、甘草苷和甘草酸濃度為5、10、25、50、100、250 mg/L，防己諾林堿和毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度為1、2、5、10、20、50 mg/L的系列對照品溶液，依次注入液相色譜儀，測定色譜峰面積，以對照品的濃度X(mg/L)為橫坐標，色譜峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸的回歸方程分別為：

Y=7.1×103X-8.0×103R=0.999 9

Y=9.0×103X+2.7×103R=0.999 9

Y=5.5×104X+4.3×104R=0.999 6

Y=1.4×104X+3.1×104R=0.999 6

Y=1.8×104X+2.1×104R=0.999 9

結(jié)果表明，粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸分別在5～250 mg/L(R=0.999 9)、1～50 mg/L(R=0.999 9)、1～50 mg/L(R=0.999 6)、5～250 mg/L(R=0.999 6)、5～250 mg/L(R=0.999 9)濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

精密吸取“2.3.1”項下白術內(nèi)酯Ⅰ對照品溶液適量，置于5 mL量瓶中，用甲醇-水(70∶30,V/V)配制成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 mg/L的系列對照品溶液，依次注入液相色譜儀，測定色譜峰面積，以所含對照品的濃度X(mg/L)為橫坐標，色譜峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，白術內(nèi)酯Ⅰ的回歸方程為：

Y=6.3×105X+1.0×106R=0.999 6

結(jié)果表明，白術內(nèi)酯Ⅰ在0.05～2.5 mg/L濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度實驗

取“2.4”項下制備的粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸第4混合對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸峰面積的RSD(n=6)分別為2.6%、1.9%、2.4%、2.6%和2.6%，表明儀器精密度良好。

取“2.4”項下制備的白術內(nèi)酯Ⅰ第4對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果白術內(nèi)酯Ⅰ峰面積的RSD(n=6)為1.9%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一批次的供試品溶液，放置于室溫，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸峰面積的RSD(n=6)分別為0.7%、0.4%、0.4%、0.3%和0.2%；白術內(nèi)酯Ⅰ峰面積的RSD(n=6)為2.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性實驗

取同一批樣品6份，精密稱定，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，分別計算粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸的含量，結(jié)果上述5種成分的含量的平均值(n=6)分別為1.343、0.367、0.136、0.743、0.804 mg/L，RSD分別為1.3%、1.9%、0.4%、0.3%和0.3%；白術內(nèi)酯Ⅰ含量的平均值(n=6)為0.002 2 mg/L，RSD為1.8%，表明方法重復性良好。

2.8 回收率實驗

精密稱取已知含量(粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白術內(nèi)酯Ⅰ的含量分別為1.343、0.367、0.136、0.743、0.804、0.002 2 mg/L)的防己黃芪湯樣品溶液共9份，每份0.5 mL，精密稱定，分別加入相當于樣品中粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白術內(nèi)酯Ⅰ含量的80%、100%、120%的對照品溶液適量，各3份。按“2.3.2”項下的方法制備供試品溶液，進樣20 μL測定，計算粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白術內(nèi)酯Ⅰ的回收率和RSD，結(jié)果見表1。

表 1 防己黃芪湯樣品中各成分的回收率

2.9 樣品含量測定

制備6批防己黃芪湯供試品溶液，進樣20 μL，記錄峰面積，代入回歸方程，計算粉防己堿(A)、防己諾林堿(B)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(C)、甘草苷(D)、甘草酸(E)和白術內(nèi)酯Ⅰ(F)的含量。6批樣品測定結(jié)果見表2。

3 討 論

3.1 流動相的優(yōu)化

分別考察了乙腈-0.2 mol/L乙酸銨0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2 mol/L乙酸銨0.1%甲酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.01%三乙胺水溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液(70∶30)(三乙胺調(diào)pH至8)、乙腈-0.2%甲酸溶液和乙腈-水(60∶40)共7種流動相體系。結(jié)果表明，采用乙腈-0.2 mol/L乙酸銨0.1%甲酸溶液作為流動相時能夠獲得較好的分離效果，在該流動相條件下，白術內(nèi)酯Ⅰ的分析時間為8 min，粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸的分析時間為20 min。與文獻[15]相比分析時間明顯縮短，且藥材中其他色譜峰不干擾樣品的測定。

表 2 6批樣品測定結(jié)果(g/L)

3.2 檢測波長的選擇

一般測定含量時會選擇化合物的最大吸收波長為檢測波長。由于本實驗需要測定多個最大吸收波長不同的化合物，需要選擇可同時兼顧到多種測定成分的波長進行檢測。綜合考慮雜峰影響，基線平穩(wěn)，色譜峰峰形，最大吸收等因素，最后確定220 nm和254 nm分別作為白術和其他5種成分的檢測波長。

3.3 提取方法及提取溶劑的選擇

本實驗對比了超聲法、回流法、水浴蒸干復溶法、固相萃取法共4種提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲法出峰效果較好，受雜峰影響小，因此選擇超聲法作為防己黃芪湯的提取方法。此外，本實驗對比了50%、70%、100%乙腈溶液，50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液作為提取溶劑對防己黃芪湯中活性成分的提取效率，結(jié)果顯示70%甲醇的綜合提取效率最高，故本實驗采用70%甲醇作為提取溶劑。

中藥復方具有化學成分復雜、含量差異大等特點，建立符合中藥復方特點的專屬、靈敏的質(zhì)量控制方法是當前中藥藥效物質(zhì)基礎研究的瓶頸和難點。本實驗采用RP-HPLC法測定防己黃芪湯中粉防己堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白術內(nèi)酯Ⅰ共6個活性成分的含量，分離度高，操作簡便，結(jié)果準確，重復性好，分析時間短，可為防己黃芪湯的質(zhì)量標準提升提供依據(jù)。