酶法提取女貞子多糖及其抗氧化性研究

周 旋，馬 鵬,蔡 瑜，霍明洋，王兆衛(wèi)，翟曉瑞，郗艷麗

(吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,吉林 吉林 132013)

女貞子為木犀科常綠喬木植物女貞(LigustrumlucidumAit.)的干燥成熟果實[1]。研究表明女貞子主要含有多糖、黃酮類、萜類、苷類、色素、揮發(fā)油類等活性成分[2-3]。多糖是天然高分子化合物[4]，具有抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、降血糖、降血脂[7]、抗病毒、抗凝血[8]、防治骨質(zhì)疏松[9-10]以及提高免疫力[11]等多種生物活性,廣泛應(yīng)用于藥物、醫(yī)療和功能食品中。探究女貞子多糖的提取率和質(zhì)量對進一步開發(fā)女貞子資源具有十分重要的意義。本實驗以女貞子為研究對象，采用纖維素酶法提取女貞子多糖，運用單因素實驗和正交試驗優(yōu)化提取工藝，并對其進行體外抗氧化活性研究，為女貞子的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

女貞子：產(chǎn)地河北；葡萄糖：北京化工；硫酸、無水硫酸銅和鹽酸：上海德榜化工有限公司；苯酚：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚和無水乙醇：天津大茂化學(xué)試劑廠；Tris：上?；巧锟萍加邢薰?；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)和纖維素酶：Sigma公司；檸檬酸和檸檬酸鈉：西隴化工股份有限公司；L-抗壞血酸：生工生物工程股份有限公司。

BS224S電子天平：北京賽多利斯；多功能粉碎機：中南制藥機械廠；漩渦混勻器：北京大龍；GFL-230鼓風(fēng)干燥箱：天津萊玻特瑞；722型分光光度計：上海菁華科技有限公司；5810R低速離心機：艾本德公司；S220-BiopH計：梅特勒；DK-S26水浴鍋：上海精宏；AP-9901S無油真空泵：天津特賽恩斯儀器有限公司。

1.2 提取工藝流程

將女貞子恒溫烘干，粉碎過60目篩，干燥備用。稱取一定量的女貞子樣品，加入一定pH值的酶溶液，充分混勻后按一定的提取條件(酶解時間、酶解溫度、酶量和pH值)提取，沸水浴滅活，抽濾，定容，得女貞子總糖的提取液。

1.3 葡萄糖標準曲線的繪制

配置濃度為0、20、40、60、80和100 mg/L的葡萄糖標準溶液，吸取0.5 mL各濃度標準溶液于試管中，分別加入1.0 mL的苯酚溶液(質(zhì)量濃度濃度為5%)和5.0 mL的濃硫酸，混勻后40 ℃水浴30 min，流水冷卻，在490 nm處測定其吸光度。平行3組試驗，以3組吸光度A平均值為縱坐標，以3組標準品質(zhì)量濃度平均值為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4 女貞子多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定提取液總糖的含量，計算多糖提取率。

1.5 女貞子多糖提取的單因素實驗

1.5.1酶解時間對女貞子多糖提取率的影響

準確稱取1.0 g女貞子干粉，按1∶40(g/mL)料液比加入pH值為5.2檸檬酸鈉緩沖溶液30 mL，按酶量0.6%分別加入纖維素酶，50 ℃反應(yīng)30、60、90、120、150 min。待反應(yīng)結(jié)束，立即于沸水浴中滅活10 min，抽濾，取濾液測定吸光度，計算提取率。

1.5.2酶解溫度對女貞子多糖提取率的影響

準確稱取1.0 g女貞子干粉，按1∶40(g/mL)料液比加入pH值為5.2檸檬酸鈉緩沖溶液30 mL，按酶量0.6%分別加入纖維素酶，30、40、50、60、70 ℃反應(yīng)90 min，待反應(yīng)結(jié)束，立即于沸水浴中滅活10 min，抽濾，取濾液測定吸光度，計算提取率。

1.5.3酶量對女貞子多糖提取率的影響

準確稱取1.0 g女貞子干粉，按1∶40(g/mL)料液比加入pH值為5.2檸檬酸鈉緩沖溶液30 mL，按酶量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%分別加入纖維素酶，50 ℃反應(yīng)90 min。待反應(yīng)結(jié)束，立即于沸水浴中滅活10 min，抽濾，取濾液測定吸光度，計算提取率。

1.5.4pH值對女貞子多糖提取率的影響

準確稱取1.0 g女貞子干粉，按1∶40(g/mL)料液比加入pH值為4.4、4.8、5.2、5.6、6.0檸檬酸鈉緩沖溶液30 mL，按酶量0.6%分別加入纖維素酶，50 ℃反應(yīng)90 min。待反應(yīng)結(jié)束，立即于沸水浴中滅活10 min，抽濾，取濾液測定吸光度，計算提取率。

1.6 女貞子多糖提取的正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，運用L9(34)正交表，以多糖提取率為評價指標，選擇酶解時間、酶解溫度、酶量、pH值做4因素3水平試驗，每組試驗平行操作3次取平均值作為最終提取率。因素水平設(shè)計見表1。

表 1 正交試驗因素水平表

1.7 抗氧化試驗

1.7.1清除DPPH·自由基能力的測定

精確稱取19.7 mg的DPPH，用無水乙醇定容到250 mL容量瓶中，充分混勻。將提取的女貞子多糖配置成不同梯度濃度的待測樣品溶液。多糖溶液與DPPH溶液或無水乙醇溶液按1∶1混合，避光反應(yīng)30 min，517 nm波長測定吸光度，以上各管均做3組平行。計算對DPPH·自由基的清除率,并以L-抗壞血酸做陽性對照[12]。

1.7.2清除羥自由基能力的測定

取1 mL不同濃度的多糖溶液，加入9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，經(jīng)37 ℃水浴反應(yīng)0.5 h后，于510 nm下測定吸光度，以上各管均做3組平行。計算對羥自由基的清除率，并以L-抗壞血酸做陽性對照[13]。

1.7.3清除超氧陰離子自由基的能力測定

取Tris-HCl緩沖液4.5 mL(50 mmol/L，pH 8.2)于試管中，加入2.0 mL蒸餾水后充分混勻，37 ℃水浴30 min，加入2.0 mL不同濃度的女貞子多糖溶液和0.5 mL鄰苯三酚溶液(25 mmol/L,37 ℃預(yù)熱)，混勻后37 ℃水浴6 min，滴加1 mL鹽酸(10 mmol/L)終止反應(yīng)，325 nm下測定吸光值，以上各管均做3組平行。計算對超氧陰離子自由基的清除率，并以L-抗壞血酸做陽性對照[14]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，用方差分析中的LSD法對多個樣本均數(shù)進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 葡萄糖標準曲線

依據(jù)1.3方法繪制葡萄糖濃度標準曲線，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程為y=5.172 9x+0.059 2，R2=0.999 7。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1酶解時間對女貞子多糖提取率的影響

當酶解時間為30～90 min時，女貞子多糖提取率明顯增加，這是由于女貞子多糖濃度未達到飽和時，增加酶解時間有利于女貞子多糖的溶出。酶解時間過短，女貞子多糖溶出不完全，女貞子殘渣中的多糖轉(zhuǎn)化率低，易造成女貞子殘渣的浪費。隨著女貞子多糖提取時間的延長，多糖就有充分的時間從女貞子殘渣中擴散到緩沖液中。提取時間90～150 min時女貞子多糖提取率趨于平緩。故選擇60、90、120 min 3個水平用于正交實驗設(shè)計。

2.2.2酶解溫度對女貞子多糖提取率的影響

酶解溫度在30～40 ℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，女貞子多糖的提取率逐漸增大，酶解溫度在40～50 ℃范圍內(nèi)多糖提取率趨于平緩，這與纖維素酶達到最佳反應(yīng)溫度有關(guān)，此時的女貞子被酶解完全。酶解溫度在50～70 ℃范圍內(nèi)，女貞子多糖提取率降低，這表明在低于或高于最適溫度時酶活力會降低，從而影響多糖的溶出。因此選擇30、40、50 ℃ 3個水平用于正交實驗設(shè)計。

2.2.3酶量對女貞子多糖提取率的影響

酶量在0.2%～0.8%范圍內(nèi)女貞子多糖的提取率增加，當酶量在0.8%～1.0%范圍內(nèi)女貞子多糖提取率趨于平穩(wěn)。酶量增加會使成本增加，因此選擇0.6%、0.8%、1.0% 3個水平用于正交實驗設(shè)計。

2.2.4pH值對女貞子多糖提取率的影響

pH值在4.4～5.8范圍內(nèi)，女貞子多糖提取率增加，pH值在4.8～5.2范圍內(nèi)，女貞子多糖提取率趨于穩(wěn)定，當pH值大于5.2時，女貞子多糖提取率下降。pH值為4.8～5.2為纖維素酶最適pH值，在此條件下，女貞子多糖的提取率較高。當pH值超出此范圍后，纖維素酶的活反而降低，酶解細胞壁的能力降低，多糖的擴散能力減弱，提取率相應(yīng)減少。因此選擇5.2、5.6、6.0 3個水平用于正交實驗設(shè)計。

2.3 正交實驗結(jié)果

從表2中分析得出，四種考察因素對女貞子多糖提取率影響大小順序為：D>B>C>A，即pH值對女貞子多糖提取率的影響最大，酶解溫度、酶量次之，酶解時間影響較小。由實驗直觀分析和極差分析可以確定主要影響參數(shù)為A3B2C3D3，即酶解時間120 min，酶解溫度40 ℃、酶使用量1%，酶溶解的pH值為5.2。

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進行方差分析，因素D在P<0.05的水平上有顯著差異，因素A、B和C不顯著。

表 2 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4 驗證實驗

準確稱取1.0 g女貞子干粉3份，按酶解時間120 min、酶解溫度40 ℃、酶量1%和緩沖溶液pH值為5.2這一最佳條件提取3次，苯酚-硫酸法測定吸光度，計算得出女貞子多糖提取率的平均值為6.58%。

2.5 女貞子多糖的抗氧化性研究

2.5.1女貞子多糖對DPPH·自由基清除能力

女貞子多糖能清除DPPH·自由基，當質(zhì)量濃度達到2.5 g/L時，女貞子多糖和L-抗壞血酸對DPPH·自由基清除率分別為83.66%和94.54%。女貞子多糖和L-抗壞血酸的EC50值分別為0.28 g/L和0.14 g/L，女貞子多糖清除DPPH·自由基能力低于L-抗壞血酸。

2.5.2女貞子多糖對羥自由基清除能力

女貞子多糖能清除羥自由基，清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大。在質(zhì)量濃度為0～0.5 g/L時，女貞子多糖及L-抗壞血酸對羥自由基清除率都迅速增加，之后趨勢變緩；當質(zhì)量濃度達到2.5 g/L時，女貞子多糖和L-抗壞血酸對羥自由基清除率分別為60.42%和87.45%。女貞子多糖和L-抗壞血酸的EC50值分別為1.07 g/L和0.23 g/L。整體來看，女貞子多糖清除羥自由基能力低于L-抗壞血酸。

2.5.3女貞子多糖對超氧陰離子自由基清除能力

女貞子多糖能清除超氧陰離子自由基，L-抗壞血酸和女貞子多糖在0.1～1 g/L范圍內(nèi)時，自由基清除率增加較快，之后清除率變化趨勢平緩；當質(zhì)量濃度到達2.5 g/L時，女貞子多糖和L-抗壞血酸對超氧陰離子自由基清除率分別為63.48%和84.12%。女貞子多糖和L-抗壞血酸的EC50分別為0.82 g/L和0.45 g/L。整體來看，女貞子多糖清除羥自由基能力低于L-抗壞血酸。

3 討 論

采用纖維素酶法對女貞子多糖的提取工藝進行研究，考察酶解時間、酶解溫度、酶量和pH值對女貞子多糖提取率的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上進行正交試驗優(yōu)化得到酶法最佳提取工藝為：酶解時間120 min、酶解溫度40 ℃、酶量1%和pH值為5.2，優(yōu)化條件下女貞子多糖提取率高達6.58%。該方法使用可靠，可用于對女貞子多糖的提取。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，女貞子多糖對DPPH·自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，且清除DPPH·自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的EC50分別為0.28、1.07、0.82 g/L，清除效果均弱于L-抗壞血酸。