第二代測序在腫瘤臨床研究中的應(yīng)用

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250012)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，惡性腫瘤的診治已經(jīng)進(jìn)入了生物信息大數(shù)據(jù)與個(gè)體化治療相結(jié)合的精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代。在這個(gè)發(fā)展過程中，高通量測序又稱下一代測序(the Next Generation Sequencing，NGS)技術(shù)以其通量高、信息量大、靈敏度高、耗時(shí)短的優(yōu)勢發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，逐漸被越來越多的研究者所接受和采用。作為新一代的測序技術(shù)，NGS可對數(shù)以百萬計(jì)的不同DNA片段混合物進(jìn)行深度測序，使得短時(shí)間內(nèi)獲知個(gè)體或疾病的全部基因組信息成為可能。與基因芯片、單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分析和傳統(tǒng)的Sanger測序相比，高通量測序可以對從樣本中得到的DNA和RNA進(jìn)行更大規(guī)模和更高覆蓋度的快速測序，從而得到全景式的分析，并能有效檢測到發(fā)生頻率很低的DNA及RNA變化；有效克服了全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS) 中假陽性率、假陰性率較高，以及檢測到的SNP很少位于功能區(qū)，或?qū)χ虏〉南∮凶儺惡徒Y(jié)構(gòu)變異不敏感等的局限性。NGS主要包括全基因組測序(whole-genome sequencing，WGS)、全外顯子組測序(whole-exome sequencing，WES)以及目標(biāo)區(qū)域測序(targeted regionsequencing，TRS)等[1]。NGS技術(shù)帶來的“革命性”的進(jìn)步不僅為疾病的基因診斷提供了前所未有的“利器”[2-3]，而且特別適合腫瘤這類同遺傳基因及個(gè)體變異雙重相關(guān)、具有高度異質(zhì)性的復(fù)雜病種[4]。NGS技術(shù)的應(yīng)用使得腫瘤臨床和基礎(chǔ)研究面臨著歷史性的發(fā)展機(jī)遇[5]。研究者將NGS技術(shù)應(yīng)用到惡性腫瘤多個(gè)領(lǐng)域的基礎(chǔ)和臨床研究中，在腫瘤的發(fā)病機(jī)制、分子分型、診治手段及預(yù)后分析等方面獲得了一系列重大突破。本文擬結(jié)合一些典型研究對NGS在腫瘤臨床研究中的應(yīng)用作一綜述。

1 發(fā)掘腫瘤驅(qū)動基因

腫瘤細(xì)胞的生成及其惡性生物學(xué)表型的維持，有賴于某個(gè)或某些癌基因的持續(xù)活化，這些癌基因稱為腫瘤驅(qū)動基因[6]。體細(xì)胞基因突變，尤其是驅(qū)動基因突變造成的癌基因激活或者抑癌基因失活，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，尋找腫瘤的驅(qū)動基因?qū)﹃U明腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及發(fā)掘可能的藥物作用靶點(diǎn)等具有非常重要的意義。NGS的高通量、高靈敏度為其發(fā)現(xiàn)未知的基因改變提供了得天獨(dú)厚的條件，使其成為大規(guī)模發(fā)現(xiàn)腫瘤驅(qū)動基因的“利器”。在美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)起的癌癥基因組圖譜項(xiàng)目(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中[7]，研究者對276例可切除結(jié)腸癌患者的腫瘤樣本進(jìn)行了全外顯子序列、DNA拷貝數(shù)、啟動子甲基化水平、mRNA和microRNA的表達(dá)水平等遺傳學(xué)指標(biāo)的測定，發(fā)現(xiàn)除了已知的APC、TP53、KRAS等常見的突變外，ARID1A、SOX9、FAM123B/WTX等既往報(bào)道極少的突變及ERBB2、IGF2等基因的擴(kuò)增發(fā)生頻率也較高。在乳腺癌[8]、頭頸部鱗癌[9]、惡性膠質(zhì)瘤[10]、卵巢癌[11]等腫瘤當(dāng)中，TCGA協(xié)作組通過NGS的方法也發(fā)現(xiàn)了一些以前不曾報(bào)道過的突變基因。大量新驅(qū)動基因的發(fā)現(xiàn)，不僅有助于更好地探究腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，也為開發(fā)高效、安全、特異的靶向藥物提供了寶貴的候選靶點(diǎn)。HODIS等[12]利用NGS的方法，對135例黑色素瘤患者的腫瘤標(biāo)本及其相鄰正常組織進(jìn)行了全外顯子測序。研究人員總共檢測到了86 813個(gè)編碼堿基的突變，平均每百萬個(gè)堿基對中就有14.4個(gè)編碼堿基的突變，這比其他腫瘤的突變率都要高。而之后，他們還發(fā)現(xiàn)了PPP6C、STK19等6個(gè)新的黑色素瘤突變的基因，其中的PPP6C、STK19均可作為藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。

2 揭示腫瘤異質(zhì)性

尋找共同的驅(qū)動基因并開發(fā)相應(yīng)的靶向藥物是使惡性腫瘤的藥物治療獲得重大突破、從而顯著改善患者預(yù)后的重要手段。但并不是所有的腫瘤都能找到具有所謂藥靶潛質(zhì)的驅(qū)動基因，也不是所有患者都能從針對主要驅(qū)動基因的治療中獲益。其主要原因就是腫瘤中廣泛存在的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性使很多尋找腫瘤“主要”驅(qū)動基因并進(jìn)行靶向藥物研發(fā)的研究遭遇了滑鐵盧，也導(dǎo)致了很多患者對靶向治療藥物的原發(fā)性耐藥。腫瘤異質(zhì)性可理解為同一種腫瘤表現(xiàn)出不同的遺傳背景、病理類型、分化狀態(tài)、基因變異及蛋白質(zhì)表達(dá)特征。腫瘤異質(zhì)性包括空間異質(zhì)性和時(shí)間異質(zhì)性，前者包括個(gè)體異質(zhì)性、同一個(gè)體內(nèi)的瘤間異質(zhì)性和瘤內(nèi)異質(zhì)性；時(shí)間異質(zhì)性是指腫瘤發(fā)展的不同階段存在著不同的遺傳學(xué)特征。這些差異使腫瘤的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性、預(yù)后等各方面產(chǎn)生不同；更導(dǎo)致腫瘤驅(qū)動基因譜的不同及相應(yīng)藥靶的選擇障礙。腫瘤異質(zhì)性產(chǎn)生的機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)可度較高的學(xué)說有：克隆進(jìn)化學(xué)說[13]、腫瘤干細(xì)胞學(xué)說[14]和腫瘤進(jìn)化的樹干-樹枝理論[15]。全面揭示腫瘤的異質(zhì)性，就要求研究人員必須多點(diǎn)取樣，即盡量多地獲取某個(gè)患者不同部位(通常是原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶)或者不同時(shí)點(diǎn)的標(biāo)本，從而描繪出這個(gè)患者的腫瘤發(fā)病機(jī)制及動態(tài)演化的分子圖譜。

GERLINGER等[16]采集了一位腎透明細(xì)胞癌患者的9處原發(fā)灶、1處腎周轉(zhuǎn)移灶、2處胸膜轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本，測定了標(biāo)本全外顯子序列、DNA拷貝數(shù)及mRNA的表達(dá)水平等。有研究者推測，BCA52、CCR6、VHL等41個(gè)存在于所有腫瘤標(biāo)本中的基因突變可以被視為腫瘤發(fā)生早期的起源性突變，而SPATA21、ALKBH8、ERCC5等38個(gè)轉(zhuǎn)移灶中共有的突變則可能是出現(xiàn)在轉(zhuǎn)移早期，是驅(qū)動轉(zhuǎn)移、定植的關(guān)鍵基因。SESN2、CCBL2、CDKN1B等32個(gè)原發(fā)灶共有的基因，可能是在腫瘤演化的過程中形成的，可能促進(jìn)腫瘤適應(yīng)局部微環(huán)境，也可能是無意義的突變?；谝陨戏治觯邢蛩幬锏难邪l(fā)應(yīng)該針對那些存在于所有癌細(xì)胞，即在腫瘤演化早期出現(xiàn)的基因，而不只是那些存在于部分癌細(xì)胞的基因。

ELZA等[17]也在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中進(jìn)行了類似的研究。他們收集了7例NSCLC患者的25份不同部位(原發(fā)灶和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié))的標(biāo)本，進(jìn)行全基因組測序或全外顯子測序。研究者把所有的基因突變或缺失按不同的標(biāo)本中出現(xiàn)的頻率分為三類：第一類，出現(xiàn)在所有樣本中，包括廣為人知的EGFR、TP53、BRAF、ALK、AKT、PTEN等研究較多的基因；第二類，出現(xiàn)在一處但不是所有的樣本中；第三類，僅出現(xiàn)在一處樣本中。開發(fā)針對第一類基因的靶向藥物有利于更大范圍地殺滅腫瘤細(xì)胞亞群，減少腫瘤原發(fā)耐藥。在其中一例患者的標(biāo)本中，兩處標(biāo)本的病理類型表現(xiàn)為腺癌，另外兩處標(biāo)本的類型則趨向于鱗癌。而這兩種不同類型的標(biāo)本的基因突變圖譜則完全不同。由此可以推測這兩個(gè)亞群的癌細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)行為有著極大的差異。因此，針對這例患者單一位點(diǎn)的穿刺活檢極有可能造成誤診，而單一的藥物治療很可能不能覆蓋所有的癌細(xì)胞。瘤內(nèi)異質(zhì)性可以導(dǎo)致穿刺活檢的誤診，以及耐藥的發(fā)生?；诹鰞?nèi)異質(zhì)性研究的靶向藥物研發(fā)，則有望針對更大范圍的癌細(xì)胞亞群，延長耐藥出現(xiàn)的時(shí)間甚至避免出現(xiàn)耐藥。

3 揭示腫瘤分子分型

NGS技術(shù)的發(fā)展給很多腫瘤的分子病理分型帶來了突破性的進(jìn)展。以胃癌為例，半個(gè)世紀(jì)以來，胃癌的病理分型與其發(fā)病機(jī)制研究一樣進(jìn)展緩慢。1965年的Lauren分型[18](腸型、彌漫型)因其簡單、實(shí)用仍在臨床沿用，但其不涉及分子機(jī)制。2006年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同的Lauren分型對化療的反應(yīng)不同可能源于不同的病理分子機(jī)制，邁出了胃癌分子分型可貴的一步[19]。2011年，新加坡學(xué)者基于基因芯片技術(shù)，將胃癌按照基因組的特征分為基因組腸型(Genomic intestinal, G-INT)和基因組彌漫型(Genomic diffuse, G-DIF)；G-INT患者的預(yù)后明顯好于G-DIF的患者；且以5-FU為基礎(chǔ)的輔助化療在G-INT患者中療效更好；提示這種內(nèi)在分型可能是胃癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子[20]。2013年，他們在此基礎(chǔ)上又將胃癌分為了間質(zhì)型(mesenchymal)、增殖型(proliferative)和代謝型(metabolic)。增殖型胃癌細(xì)胞存在高度的基因組不穩(wěn)定性、P53突變和DNA低甲基化；代謝型對5-FU敏感，是否接受5-FU輔助治療顯著影響患者生存；而間充質(zhì)型具有腫瘤干細(xì)胞的特性，高表達(dá)CD44，對PI3K/Akt/mTOR靶點(diǎn)抑制劑敏感[21]。這些研究拓展了胃癌的分子分型及其療效預(yù)測的研究空間，為后續(xù)的重要研究奠定了基礎(chǔ)。2014年《Nature》在線發(fā)表的TCGA分型[22]堪稱NGS技術(shù)應(yīng)用于胃癌分子機(jī)制研究的里程碑，引起廣泛關(guān)注。研究者將胃癌患者組織和血液標(biāo)本進(jìn)行了6大分子平臺的測序分析，包括：成組體細(xì)胞拷貝數(shù)分析、全外顯子測序、成組DNA甲基化分析、mRNA測序、miRNA測序及成組反相蛋白分析?；趯λ脭?shù)據(jù)的分析及整合，提出了一種全新的胃癌分子分型(EB病毒陽性型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、基因組穩(wěn)定型、染色體不穩(wěn)定型)及其遺傳學(xué)特征及干預(yù)對策。2015年，亞洲癌癥研究協(xié)作組發(fā)表了基于亞洲患者標(biāo)本的ACRG的分型，基于多項(xiàng)NGS結(jié)果將患者的遺傳特征進(jìn)行分類并分析了其與預(yù)后的關(guān)系[23]。研究者根據(jù)病理標(biāo)本中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以及TP53突變的情況將胃癌分為微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)/EMT、MSI、MSS/TP53+和MSS/TP53-四種亞型。研究發(fā)現(xiàn)MSI亞型的預(yù)后最好，其主要特點(diǎn)是：高突變(ARIDIA、KRAS、PI3K-PTEN-mTOR、ALK)，低復(fù)發(fā)率，MLH1缺失，DNA甲基化，多為腸型，復(fù)發(fā)率22%；其次是MSS/TP53+，預(yù)后較好，EBV的感染較多，高突變(APC、ARID-1A、KRAS、PIK3CA、SMAD4)；而MSS/TP53-預(yù)后較差，多合并TP53突變；MSS/EMT則多為彌漫型，多為印戒細(xì)胞癌，CDH1表達(dá)缺失，突變率低，早期發(fā)病，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后最差。此外，MSS/EMT亞型中的腹膜種植率高于其他三種之和。MSI型和MSS/TP53-型的肝轉(zhuǎn)移率均高于MSS/EMT型和MSS/TP53+型。

肺大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌(Pulmonary large cell neuroendocrine carcinoma，LCNEC)是一種異質(zhì)性很強(qiáng)腫瘤，它和小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)及NSCLC之間的生物學(xué)關(guān)系仍不明確。而這種不確定性導(dǎo)致臨床上很難給出最佳的治療方案[24]。有學(xué)者利用全外顯子測序的方法，分析了45例患者的腫瘤標(biāo)本及其匹配的正常組織標(biāo)本，并將LCNEC的基因組改變與其他類型的肺腫瘤進(jìn)行了對比。研究者發(fā)現(xiàn)根據(jù)基因組的不同改變，可以將患者分為3個(gè)亞組：SCLC樣：這組患者均有TP53和RB1的基因突變或缺失，并且有一些其他的常見于SCLC的基因改變，包括MYC擴(kuò)增等；NSCLC樣：這組患者缺乏TP53和RB1的共同改變，并且存在廣泛的NSCLC樣的基因突變，例如STK11、KRAS、KEAP1突變等；良性腫瘤樣：這組患者有MEN1突變，腫瘤突變負(fù)荷較低。SCLC樣亞組和NSCLC樣亞組的許多臨床病理學(xué)特征都存在顯著差別，如SCLC樣亞組的腫瘤增殖活性更高(Ki67表達(dá)更高)，而NSCLC樣亞組表達(dá)腺癌分化標(biāo)志物的水平卻更高。另外，對于以鉑類為基礎(chǔ)的化療，SCLC樣亞組的敏感性明顯高于其他兩個(gè)亞組[25]。這項(xiàng)研究為應(yīng)用NGS手段揭示腫瘤的分子分型并指導(dǎo)臨床治療提供了新的思路。

4 為罕見突變提供治療方案

近年來，晚期惡性腫瘤的靶向治療發(fā)展得如火如荼，尤其是以幾代EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors，TKI)在EGFR突變晚期NSCLC中的持續(xù)研究和應(yīng)用為突出的代表。誠然，基于Sanger測序的結(jié)果分析也可以用于指導(dǎo)臨床對于相應(yīng)患者的選擇。但是NGS技術(shù)有著同時(shí)檢測多個(gè)基因、靈敏度更高、能夠發(fā)現(xiàn)未知或罕見突變等優(yōu)勢，對于發(fā)現(xiàn)罕見突變的患者具有不可替代的作用。以NSCLC的EGFR突變?yōu)槔?，其不常見的突變類型包?9號外顯子插入突變(約占1%)，20號外顯子插入突變(約占4%)，20號外顯子S768I突變(約占1%)，18號外顯子G719X點(diǎn)突變(約占3%)以及21號外顯子L861Q突變(約占2%)等。在HE等[26]的研究中，EGFR 19外顯子插入突變的患者對吉非替尼和阿法替尼敏感。一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，阿法替尼對于某些類型的EGFR基因罕見突變療效較好，存在EGFR基因G719X、L861Q和S768I突變的患者獲益較好，但是阿法替尼在其他突變類型中活性均較低[27]。最近報(bào)道，臨床醫(yī)生通過NGS技術(shù)鑒定了一例NSCLC患者的EGFR的G719C、S7618I罕見突變以及KRAS的E49K突變，并據(jù)此選擇阿法替尼作為治療藥物。后續(xù)隨訪發(fā)現(xiàn)服用阿法替尼11個(gè)月后，患者血清CEA明顯降低，胸椎轉(zhuǎn)移灶明顯縮小[28]。除此之外，BRAF基因突變、ALK基因重排、ROS-1基因融合以及其他未知的或者罕見的突變，都可以通過NGS進(jìn)行鑒定，這對于第一代測序來講，無論是標(biāo)本量、耗時(shí)長度還是發(fā)現(xiàn)未知突變來講，都是不可能完成的任務(wù)。

5 預(yù)測療效、跟蹤復(fù)發(fā)、判斷預(yù)后及分析耐藥機(jī)制

SCLC是一種侵襲性很高、易轉(zhuǎn)移的疾病，目前的治療手段仍然是以全身化療為主。很多患者往往是初治敏感，但是不久之后出現(xiàn)耐藥。通常把初治3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)的耐藥稱之為原發(fā)耐藥。CARTER等[29]對SCLC患者血標(biāo)本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)進(jìn)行第二代測序，利用拷貝數(shù)變化(Copy-number aberrations，CNA)建立了一個(gè)預(yù)測化療療效的模型。這個(gè)模型預(yù)測化療敏感或者耐藥的準(zhǔn)確率達(dá)到了83.3%，并且根據(jù)模型預(yù)測之后，化療敏感組和耐藥組患者的無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)，總生存期(overall survival，OS)均有顯著差異。利用這個(gè)模型，只需利用NGS技術(shù)檢測病人CTC的CNA，就可以提前判斷患者對化療的敏感性，這是其他技術(shù)手段做不到的。

近些年來，對循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)的研究以及應(yīng)用的報(bào)道越來越多。ctDNA是腫瘤患者血液中腫瘤來源的游離DNA，能全面反映患者體內(nèi)的基因變化情況，具有無創(chuàng)、可重復(fù)、患者依從性高的特點(diǎn)，而且能通過多次采樣及時(shí)有效地捕捉治療過程中腫瘤基因組變化情況，實(shí)現(xiàn)對病情發(fā)展以及治療反應(yīng)動態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測[30-31]；而且能部分克服腫瘤異質(zhì)性這個(gè)棘手的問題。雖然CTC也具備上述優(yōu)勢，但ctDNA在檢測腫瘤基因組改變等方面有著更高的靈敏度和特異度[32]。

GARCIA-MURILLAS等[33]開展的一項(xiàng)針對早期乳腺癌的臨床研究顯示，相較于現(xiàn)有檢查手段，基于NGS技術(shù)的ctDNA的突變監(jiān)測可以將術(shù)后復(fù)發(fā)的診斷時(shí)間平均提前約7.9個(gè)月。這有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)微小殘留病灶并及時(shí)采取相應(yīng)的輔助治療措施。ctDNA也可以用于反映患者對手術(shù)或者化療的響應(yīng)[34]、檢測靶基因耐藥突變[31]等方面。

EGFR敏感突變的NSCLC患者在臨床使用EGFR-TKI治療9～14個(gè)月后會出現(xiàn)耐藥，耐藥機(jī)制中最常見的是獲得性T790M突變、MET擴(kuò)增等一系列的變化。對于耐藥機(jī)制的分析也是NGS擅長的領(lǐng)域。同樣，對于T790M突變的特效藥物奧希替尼(Osimertinib)來講，也會面臨繼發(fā)耐藥的問題。有學(xué)者利用NGS技術(shù)對7例奧西替尼耐藥患者的ctDNA進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)了C797S突變；后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)C797S突變確實(shí)可以導(dǎo)致奧西替尼出現(xiàn)耐藥[35]。 PLANCHARD等[36]利用NGS技術(shù)，對2例奧西替尼耐藥患者的活檢標(biāo)本進(jìn)行了全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)HER2或MET擴(kuò)增可能是耐藥機(jī)制之一。奧西替尼與高選擇性小分子 MET 抑制劑Savolitinib聯(lián)合治療有望延緩甚至克服耐藥的發(fā)生，為這部分患者人群贏得更高的生存獲益。因此，NGS技術(shù)為跟蹤分析耐藥機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，從而促進(jìn)惡性疾病向“慢性”疾病轉(zhuǎn)化，以及實(shí)現(xiàn)晚期惡性腫瘤患者長期存活的目標(biāo)提供了有力的技術(shù)手段。

6 為免疫治療篩選適合患者

近年來，免疫治療如火如荼，針對PD-1/PD-L1及CTLA4等免疫檢定點(diǎn)的抑制劑在許多腫瘤的治療領(lǐng)域獲得了空前的成功。但是免疫治療尚存在很多爭議，其中之一就是如何篩選獲益的人群。目前通常把PD-L1存在的表達(dá)作為生物標(biāo)志物之一[37]。但這一標(biāo)志物并不完美，在很多研究中并未能篩選出免疫治療的優(yōu)勢人群[37]。腫瘤突變負(fù)荷(Tumor Mutation Burden，TMB)是一項(xiàng)逐漸受到重視的免疫治療預(yù)測指標(biāo)，TMB越多，意味著腫瘤新生抗原越多，就越有利于免疫系統(tǒng)識別腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮殺滅腫瘤的作用[38]。在實(shí)際的臨床試驗(yàn)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有著更高的突變負(fù)荷的患者在接受治療后有著更高的客觀緩解率(Objective Response Rate，ORR)以及更長的PFS[39]。錯(cuò)配修復(fù)缺陷(deficient Mismatch Repair，dMMR)及高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite instability-high， MSI-H)同樣有望作為免疫治療的重要分子標(biāo)志物之一。dMMR/MSI-H可以導(dǎo)致產(chǎn)生許多體細(xì)胞突變，進(jìn)而產(chǎn)生許多腫瘤新生抗原，誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境局部更多CD8+T細(xì)胞的浸潤，進(jìn)而發(fā)揮更強(qiáng)的殺滅腫瘤細(xì)胞的作用。在一項(xiàng)pembrolizumab的Ⅱ期臨床研究中，研究者把患者分為MMR deficient和MMR proficient兩組。前者的ORR(40%)以及無病的生存率(PFS Rate，78%)均明顯高于后者(ORR為0，而PFS Rate為11%)[40]。因此，dMMR/MSI-H也是免疫治療預(yù)測療效的分子標(biāo)志物之一。顯然，不管是TMB，還是MMR，都需要通過NGS(通常是全外顯子測序)的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。

7 總結(jié)

NGS技術(shù)極大地拓展了腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究的思路和方法，在腫瘤學(xué)的研究中扮演著越來越重要的角色。一方面，NGS將腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究推向深入，在發(fā)掘驅(qū)動基因、明確分子分型、揭示腫瘤異質(zhì)性等方面突飛猛進(jìn)；另一方面，又被越來越廣泛地應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)罕見突變、預(yù)測療效、判斷預(yù)后、跟蹤復(fù)發(fā)、分析耐藥機(jī)制及篩選免疫治療的優(yōu)勢人群等臨床治療領(lǐng)域。NGS技術(shù)在腫瘤基礎(chǔ)與臨床領(lǐng)域的深入應(yīng)用和有機(jī)結(jié)合，及其衍生出來的“同病異治”(雨傘研究)和“異病同治”(籃子研究)的理論與實(shí)踐，突破了傳統(tǒng)研究的范疇，構(gòu)成了轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的經(jīng)典范例，必將極大推動以基因大數(shù)據(jù)與個(gè)體化醫(yī)療為特征的現(xiàn)代腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，為腫瘤患者的生存獲益帶來質(zhì)的飛躍。

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