紅花醌苷對心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響

(1 濟源市第二人民醫(yī)院心血管內科，河南 濟源 459000； 2 中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院心血管內科)

急性心肌梗死已成為當今威脅人類健康的兩大主要殺手之一，而心肌缺血損傷和心肌缺血再灌注損傷是導致急性心肌梗死致死、致殘的主要病因。心肌組織缺血再灌注后可以引起心肌結構破壞、心肌細胞死亡，甚至可以導致梗死范圍擴大，其損傷機制包括氧自由基的產生、中性粒細胞的浸潤及促炎因子的釋放等等[1-4]。目前研究表明，心肌細胞也存在凋亡現象，細胞凋亡在缺血再灌注心肌損傷的發(fā)生機制中扮演著重要的角色。細胞凋亡的發(fā)生受到細胞內凋亡調節(jié)蛋白的調控，B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相關X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase 3)蛋白的比例失衡即會導致細胞凋亡[5-11]?，F代藥理學研究顯示，紅花及其活性成分具有抗凝血、抗氧化、鎮(zhèn)痛以及抗炎等活性，被用于心腦血管等疾病的治療[12-13]。紅花中主要含醌式查爾酮碳苷類化合物、黃酮類化合物、多炔、烷基二醇、有機酸以及芳香苷等化學成分，其中，醌式查爾酮碳苷類化合物由于含有醌式查爾酮的結構，被認為是其最重要活性成分之一[14-15]。本研究通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，評價紅花醌苷對心肌缺血再灌注的保護作用，并對其相關機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料來源

紅花醌苷由本實驗室前期提取和保存；SPF級SD大鼠50只，購自上海加科生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

TUNEL檢測試劑盒購自Roche公司；mRNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；逆轉錄PCR試劑盒購自TAKARA公司；蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；兔抗Bcl-2、Bax、Caspase 3和GAPDH多克隆抗體購自美國Abcam公司；HRP標記單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；PCR儀購自日本TAKARA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1心肌缺血再灌注大鼠模型的建立及其處理大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，背位固定在手術臺上；以體積分數0.75的乙醇消毒后，經頸部中央氣管切開置管，連接小動物呼吸機控制呼吸；于胸骨左緣第3、4肋間開胸，小心提起心包并剪開，輕壓右側胸腔，充分暴露心臟；在左心耳與肺動脈圓錐間前降支下2 mm處使用6-0無損傷縫線環(huán)繞冠狀動脈，將結扎線從一根聚乙稀小管中穿出，拉緊形成閉環(huán)造成缺血，缺血40 min后，松解結扎線，即發(fā)生再灌注，時間120 min。其中，假手術組大鼠只穿線不結扎冠狀動脈。建模成功后，將大鼠隨機分為模型組及紅花醌苷低、中、高劑量組。紅花醌苷低、中、高劑量組大鼠分別給予25、50和100 mg/kg的紅花醌苷腹腔注射，假手術組和模型組大鼠給予等體積的生理鹽水注射，連續(xù)7 d。

1.3.2TUNEL方法檢測心肌細胞的凋亡情況 取各組大鼠心臟組織，于40 g/L多聚甲醛中固定，脫水、浸蠟，制備蠟塊標本并切片；二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；PBS洗滌，每次3 min；加入0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液，微波輻照進行抗原修復；PBS洗滌，每次3 min；BSA溫孵育30 min，封閉特異性抗原；PBS洗滌，每次3 min；滴加50 μL TUNEL反應混合液，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌，每次3 min；滴加體積分數0.03的H2O2，室溫下孵育10 min；PBS洗滌，每次3 min；滴加50 μL轉化劑POD，37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min；PBS洗滌，每次3 min；滴加100 μL DAB顯色液；自來水沖洗，蘇木素淡染，常規(guī)脫水、透明、封片；熒光顯微鏡觀察，凋亡細胞的細胞核呈深淺不一的棕褐色，正常細胞的細胞核呈藍色。采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件對結果進行分析，灰度值越大陽性越低，灰度值越小陽性越高。

1.3.3RT-qPCR法檢測心肌組織中Bcl-2、Bax以及Caspase 3 mRNA的水平 取100 mg的心肌組織，加入1 mL Trizol；玻璃勻漿器充分勻漿后，室溫靜置5 min；將懸液轉移至1.5 mL Eppendorf管中；加入200 μL氯仿，振蕩混勻15 s；4 ℃下12 000 r/min離心15 min；將上層水相轉移至另一個1.5 mL Eppendorf管中，加入等體積異丙醇，振蕩混勻15 s，室溫下靜置10 min；4 ℃下12 000 r/min，離心15 min；棄上清液，用1 mL預冷的體積分數0.75的乙醇洗滌沉淀；4 ℃下7 500 r/min離心5 min；棄上清液，室溫下干燥5 min；加DEPC水30 μL溶解，進行純度以及濃度檢測；采用逆轉錄試劑盒進行cDNA的轉錄。設計Bcl-2、Bax以及Caspase 3的引物，同時以β-actin作為內參照，引物序列如下：Bax-F:5′-TAGCCACAGTGTTGTAAGC-3′,Bax-R:5′-TCTGATCCGTCTCAATAGTC-3′；Bcl-2-F:5′-TTGCTTGGCTGGTTCTAC-3′,Bcl-R:5′-TCTATGCCCTACCTATGAG-3′；Caspase-3-F:5′-T-CCTCGTTTCCGTGTTTG-3′,Caspase-3-R:5′-C-AGGGCATCTCCACTTTG-3′；β-actin-F:5′-TTG-TGCCTTGATAGTTCGC-3′,β-actin-R:5′-GGAG-TCCTTCTGACCCATAC-3′。反應條件為：94 ℃，3 min；95 ℃，20 s；56 ℃，20 s；72℃，30 s，共35個循環(huán)。讀取數據，計算相對值。

1.3.4Western Blot法檢測心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase 3蛋白的水平 取100 mg心肌組織，眼科剪剪碎；加入1 mL裂解液，冰浴條件下進行勻漿，冰上靜置30 min后，將勻漿液轉移至1.5 mL Eppendorf管中，4 ℃下12 000 r/min離心5 min；取上清液，采用BCA蛋白檢測試劑盒測定總蛋白含量；取蛋白樣品，加入1/4體積5×loading buffer，沸水煮5～10 min；然后上樣進行SDS-PAGE電泳；電泳結束以后轉移至PVDF膜上；取出PVDF膜，50 g/L BSA室溫封閉1 h；PBST洗滌，每次5 min；分別加入稀釋后的兔抗Bcl-2、Bax和Caspase 3多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌，每次5 min；加入HRP標記單克隆抗體，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，每次為5 min；取ECL超敏發(fā)光液A、B各300 μL，充分混勻后均勻滴到PVDF膜上，覆蓋保鮮膜；凝膠成像儀曝光保存蛋白條帶圖像，以GAPDH作為內參照，分析軟件測量目的條帶和內參照條帶的灰度值,以比值作為蛋白質相對表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌細胞凋亡變化

TUNEL分析結果顯示，假手術組、模型組以及紅花醌苷低、中、高劑量組大鼠心肌細胞凋亡指數分別為(4.12±0.18)%、(57.12±8.09)%、(48.32±7.01)%、(36.19±6.41)%和(21.37±5.38)%。假手術組大鼠心肌組織中可見本底水平細胞凋亡現象，模型組與紅花醌苷低、中、高劑量組大鼠心肌組織中可見大量細胞凋亡現象，與假手術組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，紅花醌苷低、中、高劑量組心肌組織中細胞凋亡水平顯著下降(P<0.05)，且細胞凋亡改善情況呈劑量依賴性。

2.2 各組大鼠心肌細胞中Bcl-2、Bax和Caspase 3 mRNA水平變化

RT-qPCR檢測結果顯示，與假手術組比較，模型組及紅花醌苷低、中、高劑量組大鼠心肌組織中Bax以及Caspase 3 mRNA的水平顯著升高，Bcl-2 mRNA水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，紅花醌苷低、中、高劑量組大鼠心肌組織中Bax和Caspase 3 mRNA水平下降，Bcl-2 mRNA水平升高(P<0.05)，且變化趨勢呈劑量依賴性。見表1。

2.3 各組大鼠心肌細胞中Bcl-2、Bax和Caspase 3蛋白水平變化

Western Blot檢測結果顯示，與假手術組比較，模型組及紅花醌苷低、中、高劑量組大鼠心肌組織中Bax和Caspase 3蛋白的水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，紅花醌苷低、中、高劑量組大鼠心肌組織中Bax和Caspase 3蛋白的水平顯著下降，而Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，且變化趨勢呈劑量依賴性。見表2。

3 討 論

分組Bcl?2BaxCaspase3假手術組1．34±0．231．21±0．321．07±0．21模型組0．21±0．096．12±1．094．98±1．12低劑量組0．42±0．154．99±0．893．87±1．00中劑量組0．79±0．183．12±0．812．79±0．92高劑量組1．12±0．202．88±0．912．01±0．67

分組Bcl?2BaxCaspase3假手術組0．84±0．070．12±0．030．17±0．02模型組0．11±0．031．09±0．090．53±0．04低劑量組0．20±0．020．90±0．040．40±0．05中劑量組0．39±0．040．75±0．040．29±0．03高劑量組0．65±0．050．42±0．050．20±0．02

心肌缺血再灌注后，缺血心肌組織細胞的超微結構明顯改變，細胞代謝、功能明顯下降，導致病情更加惡化，甚至不可逆轉，由此產生的病理生理過程，即為缺血再灌注損傷[16-18]。細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的作用越來越被關注，成為心肌缺血再灌注損傷研究的重要方向?，F有研究表明，缺血再灌注損傷的機制包括細胞凋亡、氧化應激及炎癥反應等，其中心肌細胞凋亡是其重要的病理生理環(huán)節(jié)之一[19-21]。

Caspase家族是細胞凋亡的介導者以及執(zhí)行者,Caspase 3處于凋亡有序級聯反應的下游，是家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，Caspase 3參與了絕大多數哺乳動物細胞的凋亡過程[22-25]。Bcl-2蛋白家族是重要的細胞凋亡調控因子,該家族可以分為兩大類，一類是以Bcl-2為代表的凋亡抑制因子，一類是以Bax為代表的促凋亡因子，Bcl-2和Bax是在功能上相互對立的凋亡調控因子，在正常生理情況下，Bcl-2和Bax處于平衡狀態(tài)，一旦機體受損產生應激反應時，Bcl-2/Bax比例失衡，尤其是Bax水平會顯著升高，導致細胞凋亡現象加劇[26-28]。本研究通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，采用TUNEL、RT-qPCR以及Western Blot手段檢測模型大鼠心肌組織細胞凋亡水平以及Bcl-2、Bax以及Caspase 3表達水平的變化，結果顯示，心肌缺血再灌注大鼠心肌組織出現明顯的細胞凋亡現象，促凋亡相關因子Bax和Caspase 3表達水平顯著上升，凋亡抑制因子Bcl-2表達水平顯著下降。說明，心肌缺血再灌注損傷激活了機體細胞凋亡信號通路。

紅花有多種藥理活性作用，在臨床實踐中，其已成為預防和治療冠心病、心肌梗死以及腦血栓等疾病的重要中藥。研究顯示其對腦梗死動物的腦組織有保護作用[29]。但是，作為紅花重要活性成分之一的紅花醌苷即醌式查爾酮碳苷類化合物，對其在心肌方面的藥理作用尚未有相關報道，本研究采用紅花醌苷對心肌缺血再灌注大鼠進行治療，結果顯示，紅花醌苷能夠顯著降低心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞的凋亡水平，下調Bax和Caspase 3表達水平，上調Bcl-2表達水平，且紅花醌苷的調控作用呈劑量依賴性。因此，紅花醌苷可能通過抑制Caspase家族細胞凋亡信號通路，調節(jié)Bcl-2蛋白家族Bcl-2/Bax比例，進而抑制心肌缺血再灌注損傷導致的細胞凋亡。

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