長鏈非編碼RNA調(diào)控乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展

鄒子歸，周晉星，馬天時，張智弘

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科， 江蘇 南京 210029)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥死亡的主要因素，每年全球有超過100萬的女性被診斷患有乳腺癌，其中約有40萬人死亡。盡管早期篩查乳腺癌在中國已得到廣泛應(yīng)用，但乳腺癌的發(fā)病率和病死率仍呈現(xiàn)上升趨勢。微陣列技術(shù)和高通量測序等科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，豐富了人們對非編碼RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)的認(rèn)識，尤其是對長鏈非編碼RNAs (long non-coding RNAs，lncRNAs)的認(rèn)識。越來越多的研究顯示lncRNAs參與了包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程，尤其是惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，探索lncRNAs介導(dǎo)的乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后評估都有至關(guān)重要的作用。

1 lncRNAs的生物學(xué)特征

人類基因組序列中僅有<2%的序列編碼蛋白質(zhì)，其余的超過98%的基因組則被轉(zhuǎn)錄成ncRNAs。過去，人們將ncRNAs視為“轉(zhuǎn)錄噪音”，然而隨著高

通量測序等技術(shù)的發(fā)展，ncRNAs在細(xì)胞及生物增殖分化和代謝等方面所發(fā)揮的重要作用越來越為人們所重視。其中，長度超過200 nt的ncRNAs被稱為lncRNAs，通常是由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ， RNA pol Ⅱ)轉(zhuǎn)錄生成[1]。lncRNAs參與選擇性剪接、蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)和表觀遺傳控制(DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾和基因沉默)等多種生物學(xué)進(jìn)程[2]。lncRNAs可以作為信號分子或microRNAs(miRNAs)靶位點的誘餌發(fā)揮作用；能與相應(yīng)的蛋白綁定，影響其下游序列的反應(yīng)；可以指導(dǎo)靶基因募集染色質(zhì)修飾酶或其他蛋白，也可以為蛋白質(zhì)復(fù)合物形成一種特定的結(jié)構(gòu)，使其能夠裝配兩種表面修飾酶，從而發(fā)揮其相應(yīng)作用[1]。

2 與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNAs

LncRNAs不僅參與了人體的生理進(jìn)程，也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。lncRNAs可以作為癌基因，也可以作為抑癌基因參與腫瘤的進(jìn)程。此外，某些lncRNAs在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶中呈現(xiàn)不同的表達(dá)形式[1]。至今為止，大量研究顯示有許多l(xiāng)ncRNAs在乳腺癌中異常表達(dá)，例如HOTAIR、MALAT- 1、BCAR4、CCAT2、H19、XIST和BC200等，它們參與乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡，影響腫瘤生長和血管形成，調(diào)控乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

2.1 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(metastasis-associa-ted lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT- 1)高表達(dá)可作為潛在的生物標(biāo)志物

MALAT- 1 又稱核富集常染色體轉(zhuǎn)錄物2(nuclear-enriched abundant transcript 2，NEAT2)，位于染色體11q13.1，其長度為8 708 bp。MALAT- 1在包括乳腺癌在內(nèi)的多種類型的腫瘤中表達(dá)升高，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MALAT- 1可與RNA結(jié)合蛋白HuR結(jié)合形成抑制性復(fù)合物，這種復(fù)合物通過與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的啟動子結(jié)合，對CD133進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)程序的進(jìn)行，從而影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，且CD133在三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)中的表達(dá)較雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性的乳腺癌高，因而TNBC中侵襲轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象更為多見[3]。MALAT- 1可競爭性結(jié)合miRNA- 1，使其表達(dá)水平降低，從而提高細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42，cdc42)的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)EMT的進(jìn)程，影響乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[4]。此外，MALAT1在多種類型的乳腺癌中高表達(dá)，且MALAT- 1的表達(dá)與ER及其在乳腺癌中的靶基因相關(guān)，并可以作為敏感性的內(nèi)分泌治療的潛在生物標(biāo)志物，具有重要的預(yù)后價值[5]。

2.2 BCAR4(breast cancer anti-estrogen resistance 4)與抗雌激素藥物的耐藥性密切相關(guān)

BCAR4位于染色體16p13.13，是在一次尋找乳腺癌內(nèi)分泌抵抗相關(guān)基因的探索中被首次發(fā)現(xiàn)的，且BCAR4與抗雌激素藥物的耐藥性密切相關(guān)，并會促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[6]。細(xì)胞外趨化因子CCL21將其信號傳遞至細(xì)胞中，間接募集BCAR4，使其與p300抑制劑Smad核相互作用蛋白1(Smad nuclear-interacting protein 1，SNIP1)結(jié)合，BCAR4與SNIP1的結(jié)合可使p300的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)活性釋放，從而導(dǎo)致組蛋白乙?；渲薪M蛋白H3K18ac的乙?；菇z氨酸/蘇氨酸-蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基1(serine/threonine-protein phosphatase 1 regulatory subunit 10，PPP1R10/PNUTS)對蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)的活性抑制解除，促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ Ser5(Pol Ⅱ Ser5)去磷酸化，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤相關(guān)致癌基因同源物2(glioma-associated oncogene homolog 2,GLI2)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[6]。

2.3 HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA (HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)對乳腺癌的預(yù)后有重要意義

HOTAIR是位于染色體12q13.13上，長度為2 158 nt的lncRNA。HOTAIR是最早被報道的參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的lncRNAs之一，它在多種類型的腫瘤中高表達(dá)。體外實驗證明HOTAIR可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。HOTAIR的5′末端與多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex2，PRC2)結(jié)合，進(jìn)而影響復(fù)合物對組蛋白 H3第27位賴氨酸的三甲基化作用 (histone H3 tri-methylated at lysine 27，H3K27me3)，從而沉默靶基因表達(dá)，其3′末端與組蛋白去甲基化酶LSD1/CoREST/REST復(fù)合物結(jié)合，使組蛋白H3第4位賴氨酸去甲基化從而激活相應(yīng)基因的表達(dá)[7]。HOTAIR通過表觀沉默MiR- 568，減弱其對活化T細(xì)胞的核因子5(nuclear factor of activated T cells 5，NAFT5)的負(fù)調(diào)控，上調(diào)鈣結(jié)合蛋白 S100A4、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)，促進(jìn)EMT進(jìn)程和乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[8]。HOTAIR可抑制位于2號染色體上的HOXD基因的轉(zhuǎn)錄，被抑制的HOXD與miR- 7啟動子結(jié)合的能力減弱，miR- 7的表達(dá)水平降低，進(jìn)而使癌基因SETDB1的表達(dá)水平升高，STAT3通路激活，從而促進(jìn)EMT進(jìn)程和乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[9]。此外，HOTAIR與ER陽性的乳腺癌密切相關(guān)，可作為ER陽性的乳腺癌的獨立預(yù)后因素，高表達(dá)的HOTAIR也預(yù)示乳腺癌細(xì)胞增殖和高侵襲轉(zhuǎn)移風(fēng)險[10]。

2.4 H19通過MiR- 675影響乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移

H19在70%的乳腺癌中高表達(dá)。H19位于染色體11p15.5，僅表現(xiàn)母系印記特征，H19與其等位基因胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)共用增強(qiáng)子，IGF2則表現(xiàn)父系印記特征。過表達(dá)H19可使乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231在軟瓊脂中形成比對照細(xì)胞更大更多的集落，注射H19轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的裸鼠，其腫瘤進(jìn)展加快[11- 12]，這說明高表達(dá)的H19對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展存在一定影響。源自H19的保守性轉(zhuǎn)錄物MiR- 675可下調(diào)泛素連接酶E3家族成員c-CbI和CbI-b的水平，從而使表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)的表達(dá)水平升高，EGFR可通過Akt和Erk信號通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[13]。H19可以通過MiR- 675促進(jìn)Slug的表達(dá)，從而下調(diào)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，影響EMT進(jìn)程，進(jìn)而影響乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[14]。

此外，在H19 /IGF2基因座內(nèi)，存在另一種lncRNA 91H，其對H19基因是反義的。91H在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并可以通過表觀遺傳學(xué)修飾上調(diào)H19/IGF2的水平從而影響乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[15]。

2.5 LincROR(long intergenic non-protein coding RNA，regulator of reprogramming，lincROR)發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA功能影響乳腺癌的進(jìn)程

LincROR位于染色體18q21.31，長度約2 600 bp，由4個外顯子組成。LincROR可以與miRNA核糖核蛋白復(fù)合物(microRNA ribonucleoprotein complex,miRNPs)相互作用并作為競爭性內(nèi)源RNA(compe-ting endogenous RNA，ceRNA)調(diào)節(jié)miR- 205的活性，抑制其下游靶基因ZEB2的降解，從而促進(jìn)EMT的進(jìn)程，促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[16]。LincROR在TNBC中高表達(dá)，且LincROR可發(fā)揮ceRNA的功能，沉默miR- 145，使其下游重要的靶基因ADP核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6，ARF6)水平升高，進(jìn)而改變E-cadherin的定位及細(xì)胞間連接，從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[17]。

2.6 結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物2(colon cancer associated transcript 2，CCAT2)影響信號通路促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移

CCAT2位于染色體8q24，此區(qū)域高度保守。目前，CCAT2已被發(fā)現(xiàn)參與多種腫瘤的形成與發(fā)展，如胃癌、食管鱗癌和乳腺癌等[18- 19]。CCAT2在乳腺癌中的表達(dá)水平顯著升高，高表達(dá)的CCAT2可促進(jìn)乳腺癌中TGF-β、Smad2和 α-SMA的蛋白表達(dá)量，而TGF-β信號通路對EMT的進(jìn)程有重要的促進(jìn)作用，由此促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[19]。此外，CCAT2可影響Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄活性，并影響其下游靶基因CCND1和c-myc的水平，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[18]。

2.7 其他LncRNAs

除了上述lncRNAs之外，人們還發(fā)現(xiàn)了許多與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的新興lncRNAs，如MEG3、AK058003、肝細(xì)胞肝癌微血管浸潤相關(guān)長鏈非編碼RNA(LncRNA associated with microvascular invasion in hepatocellular carcinoma，MVIH)、LOC554202、LINC00628和抗分化非編碼RNA(anti-differentiation ncRNA，ANCR/DANCR)等。

AK058003在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著升高，且AK058003可能通過影響γ突觸核蛋白基因(γ-synuclein gene，SNCG)的表達(dá)水平，從而促進(jìn)乳腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[20]。MVIH最早在肝細(xì)胞肝癌中被發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中高表達(dá)，MVIH的表達(dá)水平可影響細(xì)胞周期及細(xì)胞的增殖和凋亡，因此可能和乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，MVIH與乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān)，可以作為乳腺癌的一種新型生物標(biāo)志物和潛在治療靶點[21]。LOC554202在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤大小和臨床分期相關(guān)，高表達(dá)的LOC554202可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡，影響細(xì)胞周期，并可促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程[22]。

MEG3在乳腺癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，且低表達(dá)的MEG3通過減少M(fèi)DM2 mRNA的轉(zhuǎn)錄，間接引起P53蛋白的累積，累積的P53在沒有細(xì)胞應(yīng)激的狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄上調(diào)P21、Maspin和KAI1，從而抑制乳腺癌的侵襲[23]。LINC00628在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞系中低表達(dá)，且過表達(dá)LINC00628可影響細(xì)胞周期，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，并可通過Bcl-2/Bax/caspase-3信號通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。ANCR在乳腺癌和乳腺癌細(xì)胞系中低表達(dá)，ANCR與EMT的誘導(dǎo)者EZH2結(jié)合，促進(jìn)CDK1與EZH2的相互作用以促進(jìn)EZH2在Thr-345和Thr- 487的磷酸化，并且最終通過泛素-蛋白酶體途徑強(qiáng)化EZH2泛素化降解，從而抑制EMT的進(jìn)程，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[25]。

3 小結(jié)與展望

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，越來越多的與腫瘤相關(guān)的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)。LncRNAs在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中同樣具有重要地位，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，其介導(dǎo)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移涉及EMT、血管形成等多個方面，且部分lncRNAs(如本文提及的MALAT- 1、HOTAIR和MVIH等)已經(jīng)顯示出預(yù)測乳腺癌分期、存活率、乳腺癌轉(zhuǎn)移以及作為乳腺癌診斷的生物標(biāo)志物的潛能，然而理想的生物標(biāo)志物必須在生物體液(如血漿和尿液)中具有穩(wěn)定性，但lncRNAs的穩(wěn)定性在很大程度上是未知的。此外，lncRNAs作為生物標(biāo)志物仍然需要進(jìn)一步的分析和臨床實踐來驗證。在治療方面，RNA治療乳腺癌仍然存在許多挑戰(zhàn)，如最佳的給藥劑量方案、給藥途徑缺乏安全性、特異性和有效的載體等，因此將其應(yīng)用于臨床仍然存在一定的障礙。

然而對于大量的新興的、具有特征性的lncRNAs功能作用的研究和認(rèn)識，為乳腺癌的治療和生物標(biāo)志物的應(yīng)用提供了新的思路。除此之外，lncRNAs可與miRNA、mRNA和蛋白等相互作用，影響信號傳導(dǎo)通路和自噬的進(jìn)程，從而影響乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，因此，對lncRNAs的研究不應(yīng)局限于lncRNAs本身，全面系統(tǒng)地研究lncRNAs調(diào)控乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制以清晰地反映其在區(qū)分乳腺癌組織和正常組織及辨別乳腺癌分期的潛力、尋找具有高度特異性和敏感性的lncRNAs和進(jìn)一步完善RNA治療的效果，對乳腺癌的預(yù)防、診斷和治療均具有至關(guān)重要的作用，也是未來研究的重要目標(biāo)。

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