高職院校雞新城疫抗體水平檢測技能探索與實踐

吳 雙，王 濤，徐婷婷，王海燕，賀生中，黃銀云，陳長春，蔡丙嚴(yán)，謝 靜

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

0 引言

我國高職院校最根本的職能是培養(yǎng)具有實踐技能的高素質(zhì)人才，而職業(yè)技能大賽作為檢驗教育教學(xué)質(zhì)量和人才培養(yǎng)水平的重要方式，目前已經(jīng)成為展示學(xué)生創(chuàng)新能力和素質(zhì)技能的重要舞臺。舉辦全國高職院校職業(yè)技能大賽更具有重大意義，一方面通過大賽展現(xiàn)學(xué)生的技能和實踐動手能力，另一方面深化教育教學(xué)改革、推進(jìn)校企合作、促進(jìn)產(chǎn)教高度融合，最重要的是提高了學(xué)生專業(yè)素質(zhì)和綜合素質(zhì)的能力，從而促進(jìn)學(xué)生的就業(yè)競爭力和就業(yè)質(zhì)量。全國職業(yè)院校技能大賽高職組“雞新城疫抗體水平測定”賽項，是面向在校高職學(xué)生開展的全國規(guī)格最高、水平最高、參與范圍最廣的技能比賽之一。2018年全國職業(yè)院校技能大賽高職組“雞新城疫抗體水平測定”賽項考核內(nèi)容包括試驗器材準(zhǔn)備(占總成績的8%)、配制1%雞紅細(xì)胞懸液(占總成績的18%)、血凝試驗(占總成績的20%)、配制四單位病毒(占總成績的10%)、血凝抑制試驗(占總成績的20%)和抗體滴度報告(占總成績的24%)六大部分，共涉及59個評分要點，每一步驟的操作稍有不慎均對測定結(jié)果影響很大，操作細(xì)節(jié)決定競賽的優(yōu)劣。

對于此次大賽，學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)高度重視，邀請了各級行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)、專業(yè)相關(guān)指導(dǎo)教師、心理咨詢教師全方位指導(dǎo)學(xué)生備戰(zhàn)。經(jīng)過激烈角逐，我院兩名同學(xué)在比賽現(xiàn)場沉著自信，發(fā)揮出色，取得優(yōu)異成績。筆者作為該項目的指導(dǎo)教師之一，回顧比賽，總結(jié)經(jīng)驗，期望在今后比賽中取得更好的成績，同時希望為今后參賽的選手和指導(dǎo)教師提供參考；更期待針對參賽選手的“精英教育”能更好地轉(zhuǎn)向全體專業(yè)學(xué)生的“課堂教育”。

1 理論知識是源泉

本賽項以國家職業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動物疫病防治員》(三級)規(guī)定的知識和技能要求為基礎(chǔ)，測定方法按照《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T16550-2008)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[1]，因此要求學(xué)生側(cè)重學(xué)習(xí)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16550-2008)的第5(血凝試驗)和第6(血凝抑制試驗)兩個部分的專業(yè)理論知識，學(xué)生只有具備扎實的理論知識基礎(chǔ)，操作時才能有的放矢，賽場上才能夠隨機(jī)應(yīng)變，將來工作上才能更好地解決實際問題。學(xué)生無須死記硬背操作步驟，只要通過理解每一步操作的目的，多次重復(fù)操作自然就牢記雞新城疫抗體水平的操作流程。

2 器材使用是基石

該比賽中用到的儀器主要有不同規(guī)格微量移液器(精準(zhǔn))[2]、離心機(jī)(等量對稱放置)[3]、托盤天平(平)[4]、微型振蕩器(振幅時間宜)等，用到的其他材料主要有96孔V型血凝反應(yīng)板(干凈無劃痕水漬)、禽用采血器(密封性良好)、科邦滅菌橡膠外科手套(氣密性良好)、燒杯(干凈無水漬)、醫(yī)用防護(hù)口罩(遮口鼻)等，需掌握每一種器材的使用原理、操作規(guī)范及注意事項等。此外，提供的34項器材并不是全部選用，使用的原則是“夠用”，材料的所有標(biāo)識必須清晰、準(zhǔn)確無誤。

3 心理素質(zhì)是變數(shù)

參加全國職業(yè)院校技能競賽的每一位參賽選手都承受著一定的壓力，而心理因素在比賽中發(fā)揮著不可估量的作用。因此，賽前的心理訓(xùn)練重要性是不言而喻且必不可少。首先在全學(xué)院范圍內(nèi)進(jìn)行雞新城疫抗體水平檢測競賽(包括理論知識考試和實踐操作考核兩個部分)中選出10-20名初賽選手；緊接進(jìn)行層層選拔，一方面多次邀請院領(lǐng)導(dǎo)和相關(guān)專業(yè)教師觀摩點評、讓參賽選手給其他班級上相關(guān)實驗課、操作全程錄像并回放查找不足之處、突換器材的擺放位置以鍛煉選手的協(xié)作能力、變換器材以及雞籠等，盡可能模擬比賽現(xiàn)場的緊張氣氛，鍛煉參賽選手的心理素質(zhì)；，之后經(jīng)過層層篩選，最終選出認(rèn)真、負(fù)責(zé)任、有擔(dān)當(dāng)、心理素質(zhì)過硬的2位種子選手參加團(tuán)體賽。與此同時，邀請專業(yè)心理咨詢教師不定時談心以釋壓；此外，指導(dǎo)教師和選手之間、兩位選手之間的關(guān)系要非常融洽，大家要做到知無不言言無不盡，指導(dǎo)教師要做到學(xué)生的亦師亦友。最后一個重要環(huán)節(jié)是競賽前一定要按著主辦方指定的時間去熟悉考場，認(rèn)真觀察器材和操作臺的方位，研究所用器材的定位；同時清楚賽場內(nèi)的衛(wèi)生間方位。

4 移液精準(zhǔn)是核心

移液精準(zhǔn)首先要確保移液器量程要精準(zhǔn)，需要校準(zhǔn)移液器再移液。其次是移液要精準(zhǔn)，一要調(diào)準(zhǔn)量程，同時也要注意操作中量程是否移位；二要正確裝配吸頭(將移液器垂直對準(zhǔn)吸頭，稍用力下壓并向左向右轉(zhuǎn)動即可上緊)并校驗吸頭是否裝緊，吸嘴是否有歪斜或堵塞；三要正確移液，其中0.9%生理鹽水、雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原、被檢血清樣本、雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、1%雞紅細(xì)胞懸液和四單位病毒均采用正向移液法(正向移液前均潤洗3次以使吸頭內(nèi)表面達(dá)到飽和)[5, 6]，用大拇指按到第一檔并將吸頭尖端垂直浸入液面3mm左右、釋放按鈕吸入液體，放液時快速按到二擋；紅細(xì)胞泥用反向移液法[7]；

5 溶液配置是前提

5.1 1%的雞紅細(xì)胞懸液的配置

是否“一針見血而不瘀血”將嚴(yán)重影響選手的心理，規(guī)范采血前的準(zhǔn)備工作(75%酒精棉球、干棉球、抽取適量抗凝劑的采血器)、雞的保定方法(側(cè)臥)、采血手法(自成一套)、采血后需立即上下輕柔混勻后置于試管架上，之后更換乳膠手套。離心操作要細(xì)心，離心管連同離心管套一起置于事先配平好的50mL小燒杯中進(jìn)行配平，離心轉(zhuǎn)速為2 000r/min，三次離心時間依次為5min、5min和8min，第一次離心后棄凈白細(xì)胞和血小板程度將嚴(yán)重影響后續(xù)操作。利用反向吸液法吸取紅細(xì)胞泥配成體積分?jǐn)?shù)為1%的紅細(xì)胞懸液，1%雞紅細(xì)胞懸液制備的優(yōu)劣將直接決定了試驗的進(jìn)度和結(jié)果。

5.2 4單位病毒的配置

配制4單位病毒(4HAU)時，首先根據(jù)血凝(HA)效價和被檢測樣本數(shù)量，準(zhǔn)確計算出抗原和生理鹽水用量；然后用移液器精確吸取所需抗原量，吹打到已經(jīng)加入生理鹽水的50mL小燒杯內(nèi)并充分混勻。因4HAU濃度直接影響試驗結(jié)果，在備賽初期要做回歸實驗以校正4HAU 病毒的配制濃度(前2 孔完全凝集且第2 孔為完全凝集的終點)。此外，4HAU要現(xiàn)配現(xiàn)用，不可長時間置于室溫中。

6 均勻性是靈魂

6.1 液體的均勻性

本試驗加入的液體除商品化的生理鹽水外，1%的雞紅細(xì)胞懸液、4單位病毒、被檢血清加樣前要預(yù)先混勻。1%雞紅細(xì)胞懸液在配制時需徹底用手搖勻或用移液器吹勻，在加樣過程中要每加3～5個樣就輕輕搖動幾下，尤其要注意在血凝抑制試驗時要徹底搖勻或吹勻后才可加樣，同一試驗不可更換紅細(xì)胞；通過肉眼觀察無法判斷4單位病毒是否混勻，所以在配制時一定要徹底用手搖勻，時間不要少于30秒，或通過移液器徹底吹均勻；被檢血清徹底融化后用手震搖數(shù)次即可。

6.2 取液的均勻性

除紅細(xì)胞泥以外，取其他液體均需要潤洗，微量的取液均要潤洗相同的次數(shù)；正向取液時，移液器排空液體時均需快速打至第二檔；取樣和倍比稀釋時均避免產(chǎn)生氣泡，倍比稀釋的次數(shù)要相同，倍比稀釋后的加樣一律從后往前加樣。盡量在液面同一高度吸取1%的雞紅細(xì)胞懸液和4HAU。

6.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性

雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原、雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均按照每次用量分裝至無菌指形管中，用前取出避免反復(fù)凍融，室溫融化至恢復(fù)室溫，否則會影響他們的效價。每次取出的抗原均需重新測定血凝價才能進(jìn)行后續(xù)試驗。

7 操作過程要縝密

HA試驗與血凝抑制(HI)試驗是檢測OIE一類傳染病中新城疫和禽流感的常規(guī)方法，該方法操作簡便、準(zhǔn)確、迅速，是在基層臨床中廣泛推廣的檢測檢疫手段，試驗結(jié)果受到操作技術(shù)影響非常大，所以整個操作過程必須縝密，才能保證試驗結(jié)果的精準(zhǔn)性。

7.1 血凝試驗

首先，在反應(yīng)板橫放(1-12孔與操作臺邊緣平行)，正面編寫HA、1、2和3(依次表示的含義為血凝試驗，1、2、3排重復(fù))標(biāo)識。移液器使用時需保持垂直，遵循“緩吸快打”原則，懸空加樣需保持吸頭嘴與反應(yīng)板孔之間的距離。

1-12孔每孔加入25uL生理鹽水，其中第12孔再補(bǔ)加25uL生理鹽水，共加樣三橫排；更換吸頭，在每排第1孔中加入25uL新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原，每加樣一次更換一次吸頭；將第1孔液體吹打三次后轉(zhuǎn)移25uL混合液至第2孔(倍比稀釋時注意吸頭深入液面的高度，避免吸入空氣產(chǎn)生氣泡)，再次吹打均勻轉(zhuǎn)移25uL混合液至第3孔，按照這樣的操作依次倍比稀釋至第11孔，棄去25uL混合液；每行倍比稀釋均需要更換吸頭；從后往前1-12孔每孔加入25uL生理鹽水；從后往前1-12孔每孔加入25uL 1%雞紅細(xì)胞懸液；微量振蕩器適度震蕩后，靜置感作，在靜置反應(yīng)25min后每隔幾分鐘進(jìn)行觀察一次，待對照孔出現(xiàn)正確的結(jié)果后方可讀數(shù)。此感作期間，需在A4紙上記錄操作的關(guān)鍵時間點；將結(jié)果記錄到實驗報告單后再舉手示意，靜待裁判評判。

7.2 血凝抑制試驗

首先，在反應(yīng)板橫放，在第一塊反應(yīng)板正面寫上HI①、1-8(依次表示的意思為血凝抑制試驗，第1至第8份被檢血清)標(biāo)識，在第二塊反應(yīng)板上標(biāo)識HI②、8-16(依次表示的意思為血凝抑制試驗，第9至第16份被檢血清)；在第三塊反應(yīng)板上標(biāo)識HI③、17-20、+、-(依次表示的意思為血凝抑制試驗，第17至第20份被檢血清、雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陰性血清)。后續(xù)試驗以“板”為單位進(jìn)行操作。

在等待HA結(jié)果期間，HI① 反應(yīng)板每孔加入25uL生理鹽水，第12豎排中的每孔補(bǔ)加25uL生理鹽水；更換吸頭，在每豎排第1孔依次加入25uL 1-8份待檢血清，每加樣一次更換一次吸頭；倍比稀釋至第10孔、棄去25uL混合液(血清易產(chǎn)生氣泡且氣泡不易破滅，倍比稀釋時應(yīng)特別避免吸入空氣而產(chǎn)生氣泡)，每行倍比稀釋均需要更換吸頭；HI② 和HI③ 反應(yīng)板操作方法同HI① 反應(yīng)板。在讀取HA結(jié)果前完成3塊反應(yīng)板的血清倍比稀釋工作。

根據(jù)HA效價配置適量的4HAU，HI① 反應(yīng)板1-11孔從后往前加入25uL 搖勻的4HAU，混勻后靜置感作；HI② 和HI③ 反應(yīng)板操作方法同HI① 反應(yīng)板；在此感作期間記錄操作的關(guān)鍵時間點。

以“板”為單位，HI① 反應(yīng)板從后往前1-12孔每孔加入25uL 1%雞紅細(xì)胞懸液，混勻后靜置；HI② 和HI③ 反應(yīng)板操作方法同HI① 反應(yīng)板；在靜置感作25min后隔幾分鐘進(jìn)行觀察一次，待對照孔出現(xiàn)正確的結(jié)果后方可讀數(shù)；感作期間在A4紙上記錄操作的關(guān)鍵時間點；同樣將結(jié)果記錄到實驗報告單后再舉手示意，靜待裁判評判。

8 適宜感作是重點

加完4HAU震蕩后的感作時間宜為30min，血凝試驗和血凝抑制試驗加完1%紅細(xì)胞懸液震蕩的感作時間不能嚴(yán)格按照否達(dá)到40min 來判定，需要結(jié)合陰性和陽性對照組出現(xiàn)的結(jié)果來判定。因為反應(yīng)時間與加入檢測樣本的準(zhǔn)確性、震蕩的強(qiáng)度、震蕩的時間和環(huán)境的溫濕度均有很大關(guān)系。本實驗需在20℃～25℃室溫進(jìn)行反應(yīng)，溫度過低會導(dǎo)致紅細(xì)胞沉淀的時間延長、HI試驗滴度與標(biāo)準(zhǔn)滴度相差1～2個log2；溫度過高會導(dǎo)致試驗結(jié)果出現(xiàn)快、但會加速新城疫病毒的解離、甚至紅細(xì)胞的自溶。此外，應(yīng)避免將反應(yīng)板置于空調(diào)出風(fēng)口下進(jìn)行操作和反應(yīng)，否則會造成液體揮發(fā)較快，造成試驗結(jié)果有偏差。

9 結(jié)果判定是關(guān)鍵

結(jié)果判定的總分值為34分，包括血凝試驗結(jié)果判定(10分)和抗體滴度報告(24分)兩個部分，在整個競賽中占比最重(34/100)。結(jié)果判定遵循“完全”原則，一是血凝試驗結(jié)果的判定，在陰性對照成立的前提下，以完全凝集1%雞紅細(xì)胞懸液的抗原的最大稀釋度，作為該抗原的血凝價；二是抗體滴度的判讀，在標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對照成立的前提下，在對照孔紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉淀到孔底時判定結(jié)果，以能完全抑制紅細(xì)胞凝集(傾斜觀察時，紅細(xì)胞完全流下)的血清的最大稀釋度作為該血清的血凝抑制價。其中抗體滴度結(jié)果在誤差±1范圍內(nèi)均可得全分，這就需要依據(jù)上述判斷原則對“過渡孔”進(jìn)行合理的判讀。

10 結(jié)語

新城疫抗體水平檢測賽項是由來自行業(yè)一線人員和具有豐富實踐經(jīng)驗的專家精心設(shè)計的，該賽項不僅拓寬了專業(yè)教師和學(xué)生的視野，改變了教師的教學(xué)觀念和學(xué)生的學(xué)習(xí)態(tài)度，還提高了師生的學(xué)習(xí)效率及心理調(diào)節(jié)能力等。我校在備賽期間，與三所高職院校師生采用“實戰(zhàn)”方式進(jìn)行相互學(xué)習(xí)和交流，這在一定程度上促進(jìn)了畜牧獸醫(yī)類專業(yè)之間的交流，為專業(yè)建設(shè)與課程改革帶來新的視角；邀請了行業(yè)、企業(yè)專家現(xiàn)場指導(dǎo)，同時通過檢測臨床樣品提高學(xué)生處理實際生產(chǎn)問題的能力；我校選拔該項競賽的種子選手來源于動物醫(yī)學(xué)院舉行全院范圍的初賽，通過該技能競賽加強(qiáng)了核心技能訓(xùn)練，有效促進(jìn)了學(xué)校建設(shè)并完善了實驗、實訓(xùn)平臺，更好地達(dá)到教學(xué)目的。為了更好地參與到以后的技能競賽，在比賽期間，指導(dǎo)教師認(rèn)真觀摩賽場實況轉(zhuǎn)播，不僅要總結(jié)自己存在的問題與不足，還要挖掘出他隊的出彩之處；賽后的點評環(huán)節(jié)需認(rèn)真記錄、消化以供學(xué)習(xí)借鑒。