西北民族大學(xué)榆中校區(qū)8種草本科植物根際產(chǎn)功能酶放線菌的篩選

車敏娜，吳 恒，武中庸，熱孜萬古力·賽買提，王國威，鄭棱峻，陳士恩

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

包括蛋白酶、淀粉酶、脂酶等在內(nèi)的功能酶在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域以及食品、飼料添加劑、化工等行業(yè)具有潛在的應(yīng)用價值。工業(yè)生產(chǎn)一般是在特殊的物理化學(xué)條件下進(jìn)行的，而在這個過程中起重要作用的酶制劑需要合適的反應(yīng)條件才能達(dá)到最佳酶活，然而通常情況下這種最佳反應(yīng)條件很難達(dá)到[1]。因此尋找能夠適應(yīng)特殊環(huán)境條件的酶制劑是關(guān)鍵。放線菌是一類能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)的微生物資源，如酶、抗生素、氨基酸、維生素、有機(jī)酸、生物堿等均由其產(chǎn)生。

植物根際是指生物和物理特性受到植物根系影響的緊密環(huán)繞根部的區(qū)域。在植物根際區(qū)域內(nèi)生長的微生物稱為根際微生物。據(jù)報道，根際區(qū)域微生物要比非根際區(qū)域微生物多19～32倍，根際放線菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和其他生理活性物質(zhì)的比例也顯著高于根際周圍土壤來源的放線菌[2]。因此，植物根際微生物是一類值得深入研究與開發(fā)的微生物資源，從根際微生物的代謝產(chǎn)物中尋找各種生物活性物質(zhì)是改善工業(yè)生產(chǎn)條件的又一重要途徑。

西北民族大學(xué)榆中校區(qū)位于甘肅省中部、省會蘭州東郊的榆中縣，榆中縣地處103°49′15″～104°34′40″E，35°34′20″～36°26′30″N。榆中縣內(nèi)地層發(fā)育不全，缺失整個古生界和中生界的三疊系。縣境內(nèi)的侵入巖為前古生代和早古生代晚期的酸性巖漿，其地質(zhì)構(gòu)造極其復(fù)雜。目前，還沒有針對我國西北民族大學(xué)榆中校區(qū)草本科植物根際放線菌資源的相關(guān)研究報道，本文采用了稀有放線菌資源選擇性分離方法，對采自西北民族大學(xué)榆中校區(qū)不同海拔梯度、不同植被類型的不同草本科植物根系土壤放線菌進(jìn)行分離，并對所得菌株做了部分生理活性測定，對功能酶產(chǎn)生菌做了篩選。

1 材料與方法

1.1 土樣來源及處理

2016年7月下旬從西北民族大學(xué)榆中校區(qū)以及周邊選取8個不同植被類型、不同海拔梯度(海拔1 800～2 500 m)的樣區(qū)，采集到8份具有代表性的植物的根際土(0～20 cm)，各約100 g，分裝于自封袋中，貼上標(biāo)簽后帶回榆中校區(qū)實驗室保存，以供分離放線菌之用。土樣概況及草本科植物的概況見表1。

表1 土樣的類型和采集地概況

1.2 菌種分離

1.2.1 分離培養(yǎng)基

菌種分離采用甘油精氨酸瓊脂分離培養(yǎng)基，其中含精氨酸2 g，NaCl 50 g，甘油12.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·H2O 0.000 1 g，CuSO4·5H2O 0.000 1 g，K2HPO41 g，ZnSO4·7H2O 0.000 1 g，蒸餾水 1 L，瓊脂20 g。調(diào)節(jié)pH值至8.0以上，121 ℃滅菌30 min。

在分離培養(yǎng)基中加入抑制劑可以有效抑制細(xì)菌和真菌的生長，抑菌劑配方：放線菌酮40 μg·mL-1,重鉻酸鉀75 μg·mL-1,青霉素2 μg·mL-1。

1.2.2 分離方法

取3 g土樣樣品，在120 ℃干熱條件下處理，1 h后用27 mL 6%酵母提取物溶液和270 μL 5% SDS溶液的混合液作為土樣提取液。采用稀釋涂布平板法進(jìn)行分離，計數(shù)、純化、保藏用常規(guī)方法。

1.3 代謝產(chǎn)物測定

1.3.1 MR實驗

采用的培養(yǎng)基含蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，K2HPO45 g，蒸餾水1 L，調(diào)整pH值至7.2,121 ℃滅菌20 min。甲基紅試劑由甲基紅0.1 g,95%乙醇300 mL,蒸餾水200 mL混合而成。將實驗菌接培養(yǎng)基中，2個重復(fù)，置22 ℃培養(yǎng)箱2～6 d，在培養(yǎng)液中加入一滴甲基紅試劑，陽性反應(yīng)表現(xiàn)為紅色(pH 值4.4)，陰性則為黃色(pH值6.0)。

1.3.2 硫化氫的產(chǎn)生

采用柴斯納培養(yǎng)基，含蛋白胨10 g，檸檬酸鐵0.5 g，蒸餾水1 L，pH值7.2,121 ℃滅菌20 min。將實驗菌種接種于柴斯納培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察2周后，產(chǎn)生的黑色素即為硫化氫。

1.4 功能酶產(chǎn)生菌的篩選

1.4.1 色氨酸酶

培養(yǎng)基為1%胰胨水溶液，調(diào)pH值至7.2～7.6，分裝1/4～1/3試管，于115 ℃滅菌30 min。所用試劑為對二甲基氨基苯甲醛8 g, 95%乙醇760 mL,濃HCl 160 mL。

挑取實驗菌接種于液體培養(yǎng)基中，每次2個重復(fù)，置22 ℃培養(yǎng)4、7 d，沿管壁緩緩加入3～5 mm高的試劑于培養(yǎng)液表面，陽性表現(xiàn)為液層界面為紅色，若此時顏色不明顯，可在培養(yǎng)液中加入4～5滴乙醚，輕輕搖動，使乙醚充分分散于液體中，靜置片刻后繼續(xù)添加試劑。

1.4.2 過氧化氫酶

挑取實驗菌株于干凈的玻片上，滴加3～4滴3%～10%過氧化氫溶液，觀察結(jié)果。陽性表現(xiàn)為0.5 min內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡，反之為陰性。

1.4.3 脲酶

采用培養(yǎng)基含蛋白胨1 g，NaCl 5 g，KH2PO42 g，酚紅0.012 g，葡萄糖1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH值 6.8～6.9(微黃)，于121 ℃滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至55 ℃時加入無菌尿素，使尿素終濃度為2%。將實驗菌株接種于培養(yǎng)基中，22 ℃培養(yǎng)4 d，觀察培養(yǎng)基的顏色。

1.4.4 脂酶

采用培養(yǎng)基含蛋白胨1 g，NaCl 5 g，CaCl2·7H2O 0.1 g，瓊脂9 g，蒸餾水1 L，pH值7.4，121 ℃滅菌20 min。待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時，分別加入吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80三種無菌吐溫至終濃度為1%，倒平板。劃線接種實驗菌于平板，培養(yǎng)1～2周，每天觀察。陽性表現(xiàn)為生長的周圍有模糊暈圈，否則為陰性。

1.4.5 蛋白酶

采用培養(yǎng)基含蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，明膠200 g，蒸餾水1 L，pH值7.4，于121 ℃滅菌20 min。將實驗菌接種于明膠培養(yǎng)基表面，22 ℃培養(yǎng)一周，觀察其液化程度。

1.4.6 淀粉酶

采用淀粉水解培養(yǎng)基，含可溶性淀粉10 g，K2HPO40.3 g，MgCO21 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 值7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。碘液由碘片1 g,碘化鉀2 g,蒸餾水300 mL制備而成。采用點接法接種實驗菌于淀粉培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周，待菌生長良好時，在菌落周圍滴加碘液，觀察是否有透明圈形成。

1.4.7 纖維素酶

采用纖維素水解培養(yǎng)基，含MgSO40.5 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，KNO31 g，蒸餾水1 L，pH值 7.2，121 ℃滅菌30 min。將濾紙條一端接種于液體培養(yǎng)基中，滅菌后將實驗菌接種在液面以上的濾紙條上，一個月后觀察濾紙條是否被分解。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝產(chǎn)物

表2表明，有2株菌QL04和QL08產(chǎn)H2S，18株放線菌在糖代謝過程中均無有機(jī)酸產(chǎn)生。

2.2 功能酶產(chǎn)生菌

繼續(xù)對這18株形態(tài)各異的放線菌做功能酶菌株篩選，檢測結(jié)果如表3所示，發(fā)現(xiàn)18株放線菌中有9株放線菌產(chǎn)淀粉酶，16株產(chǎn)蛋白酶，16株產(chǎn)脲酶，18株產(chǎn)過氧化氫酶，12株產(chǎn)聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯酶，14株產(chǎn)聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯酶，7株產(chǎn)聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯酶，1株產(chǎn)色氨酸酶，3株產(chǎn)纖維素酶。

表2 代謝產(chǎn)物測定結(jié)果

注：+，陽性;-，陰性。同表3。

表3 功能酶產(chǎn)生菌篩選結(jié)果

3 討論

放線菌豐富的次級代謝產(chǎn)物作為工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等行業(yè)的重要資源之一，一直備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。隨著放線菌菌種分離、純化、培養(yǎng)、鑒定等技術(shù)的發(fā)展，定會挖掘出更多的放線菌新種屬，發(fā)現(xiàn)更多的結(jié)構(gòu)新穎、用途廣泛的次級代謝產(chǎn)物。隨著各項分析技術(shù)的逐漸進(jìn)步，微生物與植物之間相關(guān)的各類信號分子及其功能的挖掘已經(jīng)

成為目前研究的熱點[3]。在根際這個特殊的生態(tài)系統(tǒng)中,根際微生物可以通過根際產(chǎn)生生長素、赤霉素或激動素類物質(zhì)影響植物生長。以往有關(guān)根際微生物-植物間互作的研究多集中在細(xì)菌和真菌，本文選取了西北民族大學(xué)榆中校區(qū)8種草本科植物根際土作為放線菌的分離源，放線菌與草本科植物間的互作[4]可能會對放線菌的生理產(chǎn)生一定的影響，有待今后做進(jìn)一步深入的研究。

[1] 司美茹,薛泉宏,來航線.放線菌分離培養(yǎng)基篩選及雜菌抑制方法研究[J].微生物學(xué)通報,2004,31(2):61-65.

[2] 袁麗杰，章廣玲，張玉琴，等. 草本科植物根際放線菌的種群多樣性及生物活性初步研究[J].中國抗生素雜志，2009,34(8):463-466.

[3] 沈仁芳,孫波,施衛(wèi)明,等. 地上-地下生物協(xié)同調(diào)控與養(yǎng)分高效利用[J].中國科學(xué)院院刊,2017,32(6):566-574.

[4] 陳伊,李舟,魏玉珍,等.根際放線菌I06203431產(chǎn)生的核苷類抗生素3431的研究[J].生物學(xué)雜志，2009，26(4)：17-20.