坦洋工夫紅茶多糖提取工藝優(yōu)化及其抑制腫瘤活性分析

孫蘇軍，紀(jì)海玉，白 云，于 娟，馮瑩瑩，董曉丹，劉安軍*

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

坦洋工夫紅茶是以來自福建福安茶樹的芽葉為原料，經(jīng)過萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等典型工藝過程精制而成的全發(fā)酵茶類[1]，富含兒茶素、茶黃素和茶紅素等多種抗氧化多酚物質(zhì)及具有生物活性的碳水化合物等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷可導(dǎo)致人體一些慢性疾病的發(fā)生，如癌癥、心血管疾病和炎癥等[3]。而紅茶多酚體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力[4-5]，可降低多種疾病的發(fā)病率，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力[6]。紅茶多糖是來源于紅茶中的一種重要的功能性碳水化合物，因其良好的水溶性而更容易被機(jī)體消化吸收[7]，但目前關(guān)于紅茶多糖提取工藝及生物活性的研究較少。

癌癥治愈困難，致死率高，嚴(yán)重影響著人類的健康[8]。近年來，一些多酚類物質(zhì)[9]和海藻硫酸多糖[10]表現(xiàn)出了優(yōu)秀的抗腫瘤活性且無明顯的副作用，而關(guān)于紅茶多糖的抗腫瘤活性則需進(jìn)一步探索。傳統(tǒng)的茶多糖提取方法為水溶醇沉法[11-12]，提取過程中的液料比、提取溫度、提取時(shí)間及浸提次數(shù)均會影響多糖得率。研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地和品種的茶葉中茶多糖的結(jié)構(gòu)和活性也不相同，河?xùn)|綠茶多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性[13]，黃山綠茶多糖具有降血糖作用[14]，紫陽綠茶多糖具有抗疲勞活性[15]，普洱茶多糖具有抗氧化功能以及抑制α-糖苷酶作用[16]等。

鑒于目前對紅茶的研究主要集中在其多酚化合物的抗腫瘤和抗氧化活性上，而對紅茶多糖的提取工藝以及其抗腫瘤活性研究鮮有報(bào)道。因此，利用響應(yīng)面法對紅茶多糖的水溶醇沉提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并初步研究其在BALB/c小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性，為紅茶多糖的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶：坦洋工夫紅茶，產(chǎn)地福建福安。

實(shí)驗(yàn)動物：BALB/c小鼠40 只，雌性，體質(zhì)量19～21 g，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部（SCXK（京）2011-0012）。

試劑：無水乙醇購自天津市江天化工技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司；真空冷凍干燥機(jī)、ST16R冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 紅茶多糖的提取工藝

工藝流程：紅茶→清洗→熱水提取→抽濾→上清液→減壓濃縮→75%乙醇醇沉→離心→沉淀→無水乙醇洗滌→加水溶解→離心→水溶液→冷凍干燥→粗多糖。

操作要點(diǎn)：將紅茶熱水提取液抽濾后，收集上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上55 ℃濃縮至約40 mL，加入3 倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，放置過夜后，混合物3 500 r/min離心15 min，收集沉淀。將沉淀用無水乙醇洗滌2 次，加去離子水溶解后棄去沉淀，將水溶液3 500 r/min離心15 min，收集上清液并將其冷凍干燥，得到紅茶多糖。

1.3.2 多糖得率的計(jì)算

按照公式（1）計(jì)算多糖得率：

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 液料比對多糖得率的影響

在提取溫度60 ℃條件下，分別以10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）的液料比提取60 min，浸提3 次。試驗(yàn)重復(fù)3 次，考察液料比對紅茶多糖得率的影響。

1.3.3.2 提取溫度對多糖得率的影響

以液料比20∶1（mL/g），分別在30、40、50、60、70 ℃溫度條件下提取60 min，浸提3 次。試驗(yàn)重復(fù)3 次，考察提取溫度對紅茶多糖得率的影響。

1.3.3.3 提取時(shí)間對多糖得率的影響

以液料比20∶1（mL/g）、60 ℃條件下分別提取40、50、60、70、80 min，浸提3 次。試驗(yàn)重復(fù)3 次，考察提取時(shí)間對紅茶多糖得率的影響。

1.3.3.4 浸提次數(shù)對多糖得率的影響

在提取溫度60 ℃條件下，以20∶1（mL/g）的液料比提取60 min，浸提次數(shù)分別為1、2、3、4、5 次。試驗(yàn)重復(fù)3 次，考察浸提次數(shù)對紅茶多糖得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定液料比、提取時(shí)間與提取溫度為自變量，多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化紅茶多糖的提取工藝，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平Table1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3.5 紅茶多糖純化方法及結(jié)構(gòu)分析

粗多糖水溶液通過反復(fù)凍融8 次，2 300×g離心20 min棄去沉淀，除掉蛋白、不穩(wěn)定多糖等大分子物質(zhì)，而后通過3 500 Da透析袋透析，除掉小分子雜質(zhì)，冷凍干燥得到冷溶性多糖組分，經(jīng)苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法分析多糖的總糖及蛋白含量，通過氣相色譜和紅外光譜分析多糖的單糖組成及結(jié)構(gòu)特性。

1.3.6 紅茶多糖體內(nèi)抗腫瘤活性測定

將40 只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4 組，分別為空白對照組（灌胃10 mL/（kg·d）生理鹽水）、模型對照組（灌胃10 mL/（kg·d）生理鹽水）、紅茶多糖低劑量組（500 mg/（kg·d））、紅茶多糖高劑量組（1 000 mg/（kg·d）），每組10 只，灌胃15 d后，在除空白對照組以外的各組小鼠右腋下接種H22腫瘤細(xì)胞（2×106個(gè)/只），并繼續(xù)灌胃21 d，每3 d記錄一次小鼠質(zhì)量，接腫瘤1 周后每天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長度（L/cm）和寬度（W/cm），計(jì)算荷瘤小鼠實(shí)體腫瘤體積（V/cm3）并繪制其變化曲線圖。按照公式（2）計(jì)算腫瘤體積：

實(shí)驗(yàn)期結(jié)束，對小鼠末次灌胃后，斷糧12 h，斷頸處死，解剖取小鼠脾臟、胸腺及腫瘤并稱質(zhì)量，按照公式（3）～（5）計(jì)算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及抑瘤率[17-18]：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對紅茶多糖得率的影響

圖1 液料比對紅茶多糖得率的影響Fig. 1 Effects of solvent-to-solid ratio on the extraction yield of polysaccharide

由圖1可知，在溶劑用量較小時(shí)，原料中的多糖不能夠全部轉(zhuǎn)移到溶劑中，造成提取不完全、多糖得率較低。增大溶劑用量可以使內(nèi)部的植物細(xì)胞和外部溶劑之間產(chǎn)生更大的濃度差，有利于多糖更迅速地?cái)U(kuò)散溶出[19]。但溶劑用量過大時(shí)，多糖得率并沒有繼續(xù)升高，甚至有降低趨勢，這可能是由于溶液濃度過低，致使后續(xù)的濃縮和沉淀工藝難度加大，操作步驟增多，造成部分多糖的損失，導(dǎo)致多糖得率下降?？紤]到節(jié)約能源，選擇30∶1（mL/g）左右的液料比比較合適。

2.1.2 提取溫度對紅茶多糖得率的影響

如圖2所示，隨提取溫度的升高，紅茶多糖的得率呈先上升后下降的趨勢，其中在30～60 ℃之間提取率顯著提高，60 ℃時(shí)達(dá)到最大值。隨著提取溫度的升高，多糖的擴(kuò)散系數(shù)增大，使水溶液中多糖的含量增加。然而，溫度過高可造成多糖的降解[20]，導(dǎo)致多糖得率降低，同時(shí)增加了能源消耗。因此，提取溫度選在60 ℃左右。

圖2 提取溫度對紅茶多糖得率的影響Fig. 2 Effect of temperature on the extraction yield of polysaccharide

2.1.3 提取時(shí)間對紅茶多糖得率的影響

圖3 提取時(shí)間對紅茶多糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharide

從圖3可以看出，在40～70 min的提取時(shí)間范圍內(nèi)，多糖得率明顯上升，在70 min時(shí)達(dá)到最大，之后提取時(shí)間的延長反而導(dǎo)致多糖得率下降。這是因?yàn)樘崛r(shí)間的延長可使多糖溶出到溶劑中變得更簡單迅速[20]，但提取時(shí)間過長也會導(dǎo)致多糖的降解，使其得率降低[21]。因此，提取時(shí)間應(yīng)控制在70 min左右。

2.1.4 浸提次數(shù)對紅茶多糖得率的影響

圖4 浸提次數(shù)對紅茶多糖得率的影響Fig. 4 Effect of number of extractions on the extraction yield of polysaccharide

由圖4可以看出，浸提3 次時(shí)，多糖得率達(dá)到最高，且繼續(xù)增加浸提次數(shù)時(shí)，多糖得率也不再有明顯的變化。說明浸提次數(shù)越多，能源消耗越大，且濃縮時(shí)的多糖損耗也會增加[22]。因此選擇浸提3 次。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)液料比30∶1（mL/g）、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間70 min、浸提3 次時(shí)，能夠得到紅茶多糖最大得率。如表2所示，將液料比、提取溫度和提取時(shí)間作為研究因素，以紅茶多糖得率為響應(yīng)值，共得到17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12 個(gè)為析因點(diǎn)，1 個(gè)為中心點(diǎn)，中心點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行5 次，用來估計(jì)誤差。運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y=10.14-1.55A＋0.71B-0.28C＋0.014AB＋0.65AC-0.33BC-1.79A2-1.98B2-1.56C2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Box-Behnken design with experimental results

表3 方差分析Table3 Analysis of variance of regression model

對紅茶多糖提取的回歸數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，以檢驗(yàn)方程的有效性和各因子的偏回歸系數(shù)，由表3可知，該試驗(yàn)選用的模型極顯著（P＜0.01），方差的失擬項(xiàng)不顯著（P=0.131 4＞0.05），說明非試驗(yàn)因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響不大。另外，所選模型的決定系數(shù)R2值為0.974 5，這表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，校正后的決定系數(shù)值為0.941 8，與R2值接近，說明了模型有充分的準(zhǔn)確性和通用性。從表3還可以看出，A、B、A2、B2、C2對多糖得率影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AC對多糖得率影響顯著（P＜0.05）；其他因素的影響不顯著。

2.2.2 交互作用結(jié)果分析

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variables on the extraction yield of polysaccharide

如圖5所示，通過對以上3 個(gè)交互作用的分析可以預(yù)測和檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值以及確定變量之間的相互關(guān)系[23]，響應(yīng)面曲線越陡，反映出各因素之間的兩兩交互作用越顯著。同樣，等高線的形狀也可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[24]。通過響應(yīng)面的陡峭程度分析發(fā)現(xiàn)，液料比對紅茶多糖得率的影響最大，其次是提取溫度和提取時(shí)間，且只有液料比和提取時(shí)間交互作用顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過Design-Expert 8.0軟件分析，得到紅茶多糖提取的最佳條件為液料比27.64∶1（mL/g）、提取時(shí)間69.73 min、提取溫度61.1 ℃，紅茶多糖的提取率達(dá)到10.56%。考慮到實(shí)際情況對上述條件進(jìn)行修正，最終的優(yōu)化條件為液料比30∶1（mL/g）、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間70 min，在此條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到多糖得率為（10.52±0.21）%，與理論預(yù)測值較接近，說明用該模型對紅茶多糖的提取進(jìn)行工藝優(yōu)化具有一定的實(shí)際可操作性。

2.4 紅茶多糖成分及結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 紅茶多糖主要成分及單糖組成

表4 紅茶多糖主要成分及單糖組成Table4 Major components and monosaccharide composition of black tea polysaccharide

如表4所示，經(jīng)凍融透析純化后紅茶多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)76%，而蛋白質(zhì)卻僅含2%。單糖組成分析發(fā)現(xiàn)在紅茶多糖中阿拉伯糖和半乳糖醛酸含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)34%和30%；其次為葡萄糖和半乳糖，所占比例為14%和13%；巖藻糖和鼠李糖含量最低。

2.4.2 紅茶多糖紅外光譜分析

圖6 紅茶多糖紅外光譜分析Fig. 6 FT-IR spectra of black tea polysaccharide within the range of 4 000–400 cm－1

由圖6可以看出，紅茶多糖在3 423.67、2 931.34、1 733.81、1 643.81、1 407.57、1 248.04、1 076.45、601.44 cm-1均表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸收峰。紅茶多糖在3 423.67 cm-1處的譜峰表示O—H基團(tuán)的伸縮振動，2 931.34 cm-1歸屬于C—H伸縮振動和彎曲振動[25]，1 733.81 cm-1和1 407.57 cm-1處的吸收峰則表示有羧基和羰基的存在[26]，表示含有糖醛酸，而在500～900 cm-1處的吸收峰則表示該多糖含有吡喃環(huán)[27]。結(jié)果表明該多糖為含有吡喃環(huán)和糖醛酸，與上述數(shù)據(jù)一致。

2.5 紅茶多糖體內(nèi)抗腫瘤活性檢測結(jié)果

2.5.1 各組小鼠體質(zhì)量變化

圖7 各組小鼠體質(zhì)量變化Fig. 7 Changes in body weight of mice in all groups

各組小鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后，開始灌胃給藥，灌胃14 d后接種H22腫瘤細(xì)胞。由圖7可知，各組小鼠體質(zhì)量在接種腫瘤細(xì)胞前無明顯差異，均無明顯的消瘦現(xiàn)象及由于藥物引起的病變及中毒現(xiàn)象[28]，體質(zhì)量穩(wěn)定，說明紅茶提取物對小鼠無不良影響，而后期由于實(shí)體腫瘤的生長導(dǎo)致荷瘤小鼠體質(zhì)量偏大。

2.5.2 荷瘤小鼠實(shí)體腫瘤體積變化

圖8 荷瘤小鼠實(shí)體腫瘤體積變化Fig. 8 Changes in tumor volume in H22 tumor-bearing mice

如圖8可知，在接種H22腫瘤細(xì)胞第8天開始，模型組小鼠的腫瘤體積大幅度增大，多糖灌胃組小鼠腫瘤體積雖然也呈上升趨勢，但是增幅緩慢，部分多糖組小鼠的腫瘤甚至出現(xiàn)先增長后萎縮的趨勢。結(jié)果表明，紅茶多糖對體內(nèi)實(shí)體腫瘤的生長有明顯的抑制作用。

2.5.3 臟器指數(shù)及抑瘤率

表5 紅茶多糖對荷瘤小鼠免疫器官及腫瘤的作用Table5 Effects of black tea polysaccharide on immune organ indexes and tumor growth inhibition in tumor-bearing mice

脾臟和胸腺是機(jī)體重要的免疫器官，脾臟和胸腺指數(shù)是反映動物機(jī)體免疫功能最基本也是最常規(guī)的指標(biāo)，已被廣泛應(yīng)用于評價(jià)機(jī)體的整體免疫狀態(tài)[29-30]。實(shí)驗(yàn)期結(jié)束后，對荷瘤小鼠進(jìn)行解剖，稱取各組小鼠的脾臟、胸腺和實(shí)體腫瘤，計(jì)算得出相應(yīng)的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和抑瘤率，如表5所示。與空白組相比，模型組荷瘤小鼠的脾臟明顯腫大（P＜0.01），胸腺嚴(yán)重萎縮（P＜0.05），而灌胃多糖組小鼠的臟器指數(shù)較模型組均有明顯的改善，更接近正常組。結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞的惡性增殖嚴(yán)重?fù)p害了模型組小鼠的免疫系統(tǒng)；而紅茶多糖可顯著抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖，有效地保護(hù)了小鼠的脾臟和胸腺，且呈劑量相關(guān)性，高劑量組（1 000 mg/kg）小鼠的抑瘤率可達(dá)66.30%。

3 結(jié) 論

以紅茶多糖得率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法獲得紅茶多糖最優(yōu)提取條件為液料比30∶1（mL/g）、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間70 min，紅茶多糖得率達(dá)10.52%，經(jīng)純化后多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)76%，主要由阿拉伯糖（34%）、半乳糖醛酸（30%）、葡萄糖（14%）、半乳糖（13%）、巖藻糖（5%）和鼠李糖（4%）組成，紅外光譜分析也表明其含有糖醛酸和吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)?？鼓[瘤動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，紅茶多糖可顯著保護(hù)荷瘤小鼠脾臟和胸腺，并抑制其體內(nèi)實(shí)體腫瘤的生長，且呈劑量相關(guān)性，高劑量組（1 000 mg/kg）小鼠的抑瘤率可達(dá)66.30%。

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