超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定5 個(gè)產(chǎn)地花椰菜和西蘭花中的23 種酚酸類化合物

馬 帥，王紀(jì)華，高 媛，王 蒙*，馮曉元*

（北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測(cè)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）又稱花菜、菜花或椰菜花，花椰菜為十字花科蕓苔屬一年生植物。西蘭花（B. oleracea L. var. italica）又名綠菜花、青花萊、嫩莖花椰菜，屬十字花科蕓苔屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種，原產(chǎn)于意大利[1]?；ㄒ撕臀魈m花中含有酚酸類化合物、類胡蘿卜素、礦物質(zhì)元素和纖維素等多種功能性物質(zhì)，其中酚酸類化合物尤其重要，其抗氧化能力高于VC、VE和類胡蘿卜素等[2-3]。此外，已有研究表明花椰菜和西蘭花中含有豐富的抗癌物質(zhì)[4-5]，平均營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及防病作用超出其他蔬菜，對(duì)人體健康有重要作用。

酚酸是指結(jié)構(gòu)中帶有酚類基團(tuán)的有機(jī)酸，約占植物源食品中酚類化合物的1/3，多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物，主要以游離和束縛形式存在[6]。酚酸廣泛存在于蔬菜、水果、豆類等植物中，近年來(lái)，大量研究表明酚酸類成分具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌等生理活性作用，對(duì)防御紫外線輻射和降低多種疾病的發(fā)生等效果顯著[7-9]。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)于酚酸的質(zhì)量評(píng)價(jià)分析方法主要有毛細(xì)管電泳法[10]、薄層色譜法[11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[14-15]等。在酚酸各種分析方法中，毛細(xì)管電泳法和薄層色譜法所費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，一般要幾到幾十小時(shí)；采用氣相色譜技術(shù)檢測(cè)時(shí)，需先對(duì)酚酸物質(zhì)衍生后再測(cè)定，酚酸沸點(diǎn)較高且不容易氣化，過(guò)程相對(duì)繁瑣。超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）比高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）具有分離效果好、靈敏度高和峰容量大等優(yōu)點(diǎn)；MS/MS法可以給出每一個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量和豐富的結(jié)構(gòu)信息，比MS靈敏度及選擇性均顯著提高，同時(shí)可以降低基質(zhì)干擾和信噪比，測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。UPLC-MS/MS采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行定量分析，具有分離效率高、分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，更適于多種酚酸的分離分析，在近幾年得到了快速的發(fā)展。方玲玲等[16]建立了UPLC-MS/MS技術(shù)同時(shí)檢測(cè)櫻桃酒中沒(méi)食子酸、4-羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸和咖啡酸5 種生物活性酚酸的方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，可用于櫻桃酒中酚酸的檢測(cè)。羅益遠(yuǎn)等[17]采用UPLC-MS/MS法測(cè)定何首烏中的酚酸。艾鑫衛(wèi)等[18]采用HPLC-MS/MS法測(cè)定各生長(zhǎng)期紫蘇中酚類物質(zhì)的含量。張娜等[19]通過(guò)超高效液相色譜法分析稻米酚酸化合物組分及其含量，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可靠，不僅適合稻米中酚酸化合物的含量測(cè)定，而且對(duì)于其他谷物中酚酸化合物含量的測(cè)定也具有一定參考價(jià)值。謝越等[20]采用HPLC法同時(shí)測(cè)定滁菊樣品中的9 種酚酸。目前，關(guān)于UPLC-MS/MS法花椰菜和西蘭花中酚酸類化合物測(cè)定的報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化，建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定花椰菜和西蘭花中23 種酚酸類化合物的分析方法，并采用該方法對(duì)5 個(gè)不同產(chǎn)地的花椰菜和西蘭花樣品進(jìn)行分析測(cè)定和比較，以期為花椰菜和西蘭花功能營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)及保健新品種開發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椰菜和西蘭花樣品采集于北京、杭州、武漢、重慶和廣州5 個(gè)產(chǎn)地，每個(gè)產(chǎn)地選取5 個(gè)有代表性的采樣點(diǎn)，將5 份樣品等比例混合為一份樣品（表1）。

表1 西蘭花、花椰菜的采樣記錄Table1 Information about vegetable samples tested in this study

酚酸標(biāo)準(zhǔn)品：沒(méi)食子酸、香豆酸、3,5-二羥基苯甲酸、新綠原酸、3,4-二羥基苯甲酸、2,3,4-三羥基苯甲酸、D-（-）-奎寧酸、綠原酸、4-羥基苯甲酸、2,5-二羥基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、2,3-二羥基苯甲酸、鞣花酸、對(duì)香豆酸、芥子酸、阿魏酸、異阿魏酸、3-羥基肉桂酸、2-羥基肉桂酸、水楊酸、肉桂酸（純度均大于97%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇（HPLC級(jí)） 美國(guó)Fisher公司；甲酸 （HPLC級(jí)）美國(guó)Sigma公司；抗壞血酸、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純） 上海安譜公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC儀-Xevo TQ三重四極桿質(zhì)譜儀（配MassLynx V.4.1軟件） 美國(guó)Waters公司；BUCHI-R-210旋蒸蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；A11分析研磨機(jī)、KS260搖床 德國(guó)IKA公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國(guó)Mimpore公司；ME104E電子天平 瑞士梅特勒公司；Vortex Genie 2多用途旋渦混合器 美國(guó)Scientific Industries公司；N-EVAP氮吹儀 美國(guó)Organomation公司；pHS-3C精密pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚酸提取

1.3.1.1 樣品研磨

取花椰菜和西蘭花樣品可食部位切成小塊，使用研磨機(jī)液氮研磨為粉末，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 游離型酚酸的提取

取2 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL提取液（80%甲醇溶液含有1%抗壞血酸），渦旋振蕩10 s，室溫超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min后將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中。重復(fù)上述提取步驟一次，合并上清液，定容至50 mL，混勻后，過(guò)0.22 μm濾膜，備用。

1.3.1.3 游離酯型酚酸的提取

取2 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL提取液（80%甲醇溶液含有1%抗壞血酸），渦旋振蕩10 s，室溫超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min后將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL旋蒸瓶中。重復(fù)上述提取步驟一次，合并上清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至10 mL以內(nèi)。轉(zhuǎn)移濃縮液至100 mL離心管中，加入20 mL 4 mol/L NaOH溶液，沖入氮?dú)饷芊狻?0 ℃氣浴振蕩避光水解2 h，后用4 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2，加入20 mL正己烷，室溫振蕩20 min，去除正己烷層。用20 mL乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液于旋蒸瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35 ℃減壓濃縮至進(jìn)干。用10 mL 50%甲醇溶液溶解，混勻后，過(guò)0.22 μm濾膜，備用。

1.3.1.4 結(jié)合型酚酸的提取

取1.3.1.3節(jié)步驟離心后的殘?jiān)?00 mL離心管中，加入20 mL 4 mol/L NaOH溶液，沖入氮?dú)饷芊狻?0 ℃氣浴振蕩避光水解2 h，后用4 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2，加入20 mL正己烷，室溫振蕩20 min，去除正己烷層。用20 mL乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液于旋蒸瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35 ℃減壓濃縮至進(jìn)干。用10 mL 50%甲醇溶液溶解，混勻后，過(guò)0.22 μm濾膜，備用。

1.3.2 酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取23 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的各酚酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20 ℃保存，可以使用12 個(gè)月。酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液采用梯度稀釋法現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 UPLC-MS/MS分析

色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 column（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），柱溫45 ℃，樣品室溫度10 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B），流速0.3 mL/min，采用梯度洗脫，0～0.5 min，95% A；0.5～5 min，95%～70% A；5～95 min，70%～10% A；9.5～9.75 min，10%～95% A；9.75～12 min，95% A（表2）。

表2 流動(dòng)相梯度條件Table2 Gradient mobile phase for UPLC

采用電噴霧電離源，采用MRM模式進(jìn)行檢測(cè)，負(fù)離子模式掃描，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃，去溶劑氣流量為1 000 L/h，錐孔氣流速為150 L/h。目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-MS/MS條件優(yōu)化

酚酸類化合物分離的流動(dòng)相體系主要包括甲醇-水和乙腈-水[21-22]，實(shí)驗(yàn)考察兩種不同流動(dòng)相體系以及在流動(dòng)相中添加甲酸對(duì)酚酸類化合物分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果明顯優(yōu)于甲醇，在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸可減少色譜峰的拖尾，增強(qiáng)樣品中待測(cè)物的保留，提高了分離效果和靈敏度。因此，本實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

在質(zhì)譜條件優(yōu)化中，考察正、負(fù)兩種離子模式測(cè)定23 種目標(biāo)化合物的響應(yīng)特點(diǎn)。結(jié)果顯示，23 種目標(biāo)化合物在負(fù)離子模式下均有較強(qiáng)的響應(yīng)，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各目標(biāo)成分在檢測(cè)條件下具有良好的穩(wěn)定性、較好的峰形和響應(yīng)值。因此，選用負(fù)離子模式進(jìn)行分析。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

花椰菜和西蘭花基質(zhì)復(fù)雜，通常需要一定的前處理去除色素及其他干擾物以提高酚酸提取效率。目前對(duì)于酚酸類檢測(cè)前處理主要有乙酸乙酯液液萃取法[23-24]和固相萃取法[25]。乙酸乙酯萃取主要是利用多酚在乙酸乙酯和水中的分配系數(shù)不同分離，該法為目前提取酚酸最為常用方法。HLB固相萃取法是一種基于反相保留的提取方法，并對(duì)各種極性非極性物質(zhì)都有均衡吸附作用。固相萃取法相比于傳統(tǒng)液液萃取法操作較為簡(jiǎn)便。研究對(duì)兩種前處理方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取法的回收率高于固相萃取法，因此選用乙酸乙酯萃取法。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 線性方程、檢出限和定量限結(jié)果

精密吸取1.3.2節(jié)的混合對(duì)照品溶液，置于10 mL容量瓶中，依次逐級(jí)稀釋，配制成一系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按照1.3.3節(jié)的條件進(jìn)行分析。以對(duì)照品的峰面積（Y）對(duì)相應(yīng)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。以各化合物信噪比為3時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為最低檢測(cè)限，結(jié)果見表4，23 種酚酸類化合物在1.0～500.0 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均不低于0.992?；旌蠈?duì)照品的色譜圖見圖1。

表4 目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table4 Linear equations, correlation coefficients (r2) and limits of detection(LODs) for target compounds

續(xù)表4

圖1 23 種目標(biāo)成分混合對(duì)照品的MRM色譜圖Fig. 1 MRM Chromatograms of twenty-three components in reference substances

2.3.2 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 目標(biāo)化合物的方法學(xué)考察結(jié)果Table5 Figures of merit of the method

取100 ng/mL的混合對(duì)照品溶液，在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算23 種目標(biāo)成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。取同一樣品供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣6 次，測(cè)定23 種目標(biāo)化合物峰面積的RSD，考察其穩(wěn)定性。取同一樣品，按照2.3.1節(jié)方法平行制備3 份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算23 種目標(biāo)成分峰面積的RSD，考察方法的重復(fù)性。結(jié)果表明，儀器精密度良好，23 種目標(biāo)化合物在24 h內(nèi)穩(wěn)定，方法的重復(fù)性好，結(jié)果見表5。方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，RSD均小于5.10%。

2.3.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取2 g（6 份）已知含量的西蘭花樣品于離心管中，分別加入100 ng/g的對(duì)照品溶液，按照1.3.1節(jié)的方法制備加樣回收率供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算目標(biāo)化合物的回收率及RSD，結(jié)果見表5。加標(biāo)回收率為81.32%～100.39%，RSD均不大于6.21%。加標(biāo)回收樣品（100 ng/g）的MRM色譜圖見圖2。

圖2 加標(biāo)回收樣品（100 ng/g）的MRM色譜圖Fig. 2 MRM Chromatograms of spiked samples (100 ng/g)

2.3.4 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

按照1.3.1節(jié)方法制備5 個(gè)產(chǎn)地的花椰菜和西蘭花樣品，按照1.3.3節(jié)方法測(cè)定，根據(jù)相應(yīng)的線性計(jì)算供試樣品23 種酚酸的含量，結(jié)果見表6、7。測(cè)定樣品的MRM色譜圖見圖3。

圖3 測(cè)定樣品的MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of real samples

如表6所示，花椰菜中共檢出9 種酚酸。其中，游離形態(tài)酚酸檢出芥子酸（0.11～0.13 mg/kg）和對(duì)羥基苯甲酸（0.43～1.19 mg/kg），不同產(chǎn)地的游離酚含量差異顯著。酯型酚含量為0.32～4.28 mg/kg，其中產(chǎn)地北京的花椰菜中酯型酚含量均顯著高于其他4 個(gè)產(chǎn)地，可能是由于貯運(yùn)造成酯型酚降解。結(jié)合酚檢測(cè)出3 種，芥子酸（0.87～1.59 mg/kg）、阿魏酸（0.30～0.99 mg/kg）和對(duì)香豆酸（0.28～0.53 mg/kg）。不同產(chǎn)地花椰菜中所檢出的3 種形態(tài)的酚酸含量有差異顯著，這可能與花椰菜品種、采收成熟度及貯運(yùn)時(shí)間等有關(guān)。與文獻(xiàn)[26-27]的研究結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本研究檢出的2,3-二羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲酸文獻(xiàn)中未見報(bào)道，文獻(xiàn)中綠原酸和丁香酸的檢測(cè)在本研究中未檢出，可能是由于前處理和檢測(cè)方法不一致。

西蘭花中共檢出10 種酚酸，如表7所示，其中，游離形態(tài)酚酸檢出2 種：新綠原酸含量為0.82～3.09 mg/kg，對(duì)羥基苯甲酸含量為0.29～1.10 mg/kg。酯型酚中芥子酸（24.61～62.89 mg/kg）和阿魏酸（21.08～43.26 mg/kg）含量較高，其余幾種酯型酚含量均低于10 mg/kg。結(jié)合酚檢出芥子酸（3.40～5.99 mg/kg）、阿魏酸（4.61～7.83 mg/kg）和對(duì)香豆酸（0.59～0.80 mg/kg）。不同產(chǎn)地西蘭花中所檢出的3 種形態(tài)的酚酸含量差異顯著，這可能與西蘭花的品種、采收成熟度及貯運(yùn)時(shí)間等有關(guān)。與文獻(xiàn)[28-29]研究結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本研究檢出的2,3-二羥基苯甲酸、原兒茶酸、龍膽酸和對(duì)羥基苯甲酸文獻(xiàn)中沒(méi)有報(bào)道，綠原酸本研究未檢出，可能是由于前處理和檢測(cè)方法不一致。

表6 不同產(chǎn)地花椰菜中不同形態(tài)酚酸含量（s，n=3）Table6 Contents of phenolic acids in cauliflower from different producing areas s, n= 3)

表6 不同產(chǎn)地花椰菜中不同形態(tài)酚酸含量（s，n=3）Table6 Contents of phenolic acids in cauliflower from different producing areas s, n= 3)

注：ND.未檢出。表7同。

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表7 不同產(chǎn)地西蘭花中不同形態(tài)酚酸含量s，n=3）Table7 Contents of phenolic acids in broccoli from different producing areass, n= 3)

表7 不同產(chǎn)地西蘭花中不同形態(tài)酚酸含量s，n=3）Table7 Contents of phenolic acids in broccoli from different producing areass, n= 3)

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3 結(jié) 論

酚酸類化合物的準(zhǔn)確定性定量分析是開展蔬菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)研究及功能性食品研發(fā)必備的技術(shù)基礎(chǔ)。目前已有一些采用普通高效液相色譜測(cè)定紫山藥、果蔬汁和紫蘇中酚酸類化合物的研究報(bào)道[18,30-31]。但是普通高效液相色譜存在分析時(shí)間較長(zhǎng)、分離度較差等問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)多種酚酸的聯(lián)合分析測(cè)定。本研究通過(guò)UPLC-MS/MS法，在9 min內(nèi)快速有效地分離23 種酚酸化合物，顯著提高了酚酸類化合物的分離效率，采用MRM模式進(jìn)行定性定量分析，方法靈敏度及選擇性均顯著提高，同時(shí)可以降低基質(zhì)干擾和信噪比，測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。本研究建立的UPLC-MS/MS法能夠快速、準(zhǔn)確地測(cè)定花椰菜和西蘭花中23 種酚酸化合物，23 種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均不低于0.992，回收率在81.32%～100.39%之間，RSD均不大于6.21%。該方法顯著縮短了分析時(shí)間，而且穩(wěn)定性好、靈敏度高，可以為花椰菜和西蘭花等蔬菜中酚酸類功能營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)及保健新品種開發(fā)提供技術(shù)支持。

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