α7神經(jīng)型尼古丁受體激動劑PNU282987對小鼠海馬組織突觸相關(guān)蛋白的影響

王曉玲 鄧于新 董陽婷 官志忠，2 齊曉嵐

(貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

神經(jīng)型尼古丁受體(nAChR)在腦中分布廣泛，參與大腦的學(xué)習(xí)、認(rèn)知、記憶等諸多過程，并參與了多種其他受體功能活動的調(diào)節(jié)，而且具有神經(jīng)保護(hù)作用，抵抗各種細(xì)胞毒性〔1〕，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，包括谷氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺及去甲腎上腺素等，提高記憶和學(xué)習(xí)能力及認(rèn)知功能，具有參與一系列神經(jīng)生物學(xué)功能的潛力〔2〕。α7nAChRs是配體門控離子通道家族中的成員，由5個跨膜亞基組成，有1個大的胞外N-端，4個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域〔3〕。激活α7nAChR能夠引起一系列級聯(lián)放大反應(yīng)，調(diào)控著與大腦神經(jīng)遞質(zhì)傳遞相關(guān)的各種活動〔4〕。本研究特異性激動小鼠α7nAChR水平，研究其對囊泡相關(guān)蛋白突觸素(Syn)、突觸小體相關(guān)蛋白(SNAP)-25和突觸后致密物(PSD)-95表達(dá)水平的影響探討α7nAChR對突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響并進(jìn)一步明確α7nAChR神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1動物 32只6月齡C57雄性野生型小鼠，體重20～30 g，購自上海南方模式生物公司(動物許可證號：SCXK(滬)2014-0002)。實(shí)驗(yàn)動物遵照國家實(shí)驗(yàn)動物使用和飼養(yǎng)指南，采用獨(dú)立通風(fēng)柜飼養(yǎng)，動物房常年溫度控制在(24±2)℃，濕度40%～60%，光照時間8：00～21：30。所有動物均飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 SPF 級環(huán)境。實(shí)驗(yàn)操作均獲得貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的許可。

1.2藥物與試劑 α7nAChRs 特異性激動劑PNU-282987購于Sigma公司(美國)；兔抗α7nAChR(H-302)多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體：sc-81178、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠二抗：sc-2005等均購于Santa Cruz 公司(美國)；兔抗Syn單克隆抗體(D35E4)、兔抗PSD-95 單克隆抗體(D27E11)均購于CST公司(美國)；SNAP-25(GTX113839)單克隆抗體、高分子量蛋白 Marker購于GeneTex公司(美國)；抗兔二抗#7074購于CST 公司(美國)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒等購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超敏增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒、聚二氟乙烯(PVDF)膜購于Amersham公司(美國)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于 Thermo 公司；Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)購于 Roche 公司(德國)；Trizol試劑購于Invitrogen 公司；β-actin、Syn、PSD-95、SNAP-25定量PCR引物均由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成。

1.3分組與給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1個月后，將32只C57雄性野生型小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對照組(Control)、小鼠腹腔注射PNU-282987 0.5、1.0、3.0 mg/kg實(shí)驗(yàn)組，連續(xù)腹腔注射5 d。然后腹腔注射4%水合氯醛(0.2 ml/10 g)麻醉，開胸暴露小鼠心臟，穿刺針經(jīng)左心室穿刺至升主動脈，用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)40 ml灌注沖洗血管床約5 min，取出大腦組織，在冰上收集海馬組織，于-80℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4方法

1.4.1Real-time PCR檢測Syn、PSD-95、SNAP-25、β-actin mRNA 表達(dá)水平 運(yùn)用Trizol一步法提取組織總 RNA后逆轉(zhuǎn)錄mRNA構(gòu)建cDNA文庫，再以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量 PCR。Syn、PSD-95、SNAP-25、β-actin的引物序列見表1。用ABI Step One Plus型Real-time PCR儀，采集內(nèi)參β-actin及Syn、PSD-95、SNAP-25基因擴(kuò)增各循環(huán)的熒光信號，以SDS2.1軟件先收集熒光信息后分析數(shù)據(jù)。以β-actin作為內(nèi)參對照，計算Syn、PSD-95、SNAP-25基因的相對水平(RQ=2-△△Ct)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段

1.4.2蛋白表達(dá)水平測定 按RIPA∶PMSF=100∶1配制裂解液，收集小鼠大腦海馬組織，用冷凍離心機(jī)12 000 r/min、4℃、20 min離心，收集上清液即為蛋白質(zhì)。蛋白濃度運(yùn)用二喹啉甲酸(BCA)定量法測定；采用Western印跡法檢測Syn、PSD-95及SNAP-25蛋白表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參對照。采用ImageJ軟件處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析各條帶灰度值，以Syn、PSD-95及SNAP-25蛋白條帶與內(nèi)參β-actin的比值表示目的蛋白表達(dá)的相對水平。獨(dú)立重復(fù)3次試驗(yàn)，每次3個復(fù)孔。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS24.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組Syn mRNA 及蛋白表達(dá)水平 相對于Control組(設(shè)為1)，1.0、3.0 mg/kg PNU-282987組明顯上調(diào)海馬Syn mRNA(1.378±0.031，1.428±0.059)及蛋白(211.29±6.85，230.00±8.42)表達(dá)水平，而0.5 mg/kg PNU-282987組與Control組相比Syn mRNA水平(1.201±0.089)上調(diào)，但Syn蛋白表達(dá)水平(109.59±33.19)無明顯差異。見圖1。

2.2各組PSD-95 mRNA及蛋白表達(dá)水平 相對于Control組(設(shè)為1)，0.5、1.0、3.0 mg/kg PNU-282987組明顯上調(diào)海馬組織中PSD-95 mRNA(1.166±0.050，1.357±0.055，1.649±0.075)及蛋白(184.20±6.48，219.70±6.54，255.10±10.95)表達(dá)水平。見圖2。

2.3各組SNAP-25 mRNA及 蛋白表達(dá)水平 相對于Control組(設(shè)為1)，0.5、1.0、3.0 mg/kg PNU-282987組明顯上調(diào)海馬組織中SNAP-25 mRNA(1.282±0.053，1.519±0.054，1.695±0.061)及蛋白(151.84±13.15，172.62±9.47，179.46±4.36)表達(dá)水平。見圖3。

圖1 各組小鼠海馬 Syn蛋白表達(dá)水平

圖2 各組小鼠海馬PSD95蛋白表達(dá)水平

圖3 各組小鼠海馬SNAP25蛋白表達(dá)水平

3 討 論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，nAChR存在于神經(jīng)元后突觸、前突觸及神經(jīng)元的軸突區(qū)域。不同的尼古丁受體亞型由亞基以不同的組合方式構(gòu)成不同的五聚體，參與 Ca2+、K+和Na+等離子在細(xì)胞中流動的調(diào)控〔5〕，對神經(jīng)元的興奮性進(jìn)行調(diào)節(jié)并對動物的行為產(chǎn)生影響，特別是記憶、學(xué)習(xí)等認(rèn)知過程，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用〔6〕。α7nAChR是其中在海馬和皮層神經(jīng)元中高表達(dá)的亞型〔7〕，激活的α7nAChR 可以對神經(jīng)遞質(zhì)釋放、神經(jīng)元興奮性及突觸的可塑性產(chǎn)生影響〔8〕。在某些疾病如阿爾茨海默病(AD)患者中觀察到膽堿能損傷與α7nAChR 表達(dá)水平下降有關(guān)〔9〕。且最近有研究表明在老年AD動物模型中激動α7nAChR會對其學(xué)習(xí)、記憶能力產(chǎn)生影響〔10〕。膽堿能神經(jīng)功能缺陷在許多疾病發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。α7nAChR與AD、癲癇、精神分裂癥、肺癌、帕金森病(PD)、炎癥及動脈粥樣硬化等的發(fā)病具有非常緊密的關(guān)系〔11〕。研究表明，α7nAChR在AD及精神分裂患者的治療中，可以比較顯著地改善其認(rèn)知功能障礙〔12〕。PNU是α7nAchR的強(qiáng)效高選擇性激動劑，與其他nAchR的亞單位結(jié)合微乎其微，是α7nAchR激動劑中特異性較高的合成物〔13〕。美國輝瑞公司的研究者也提出同樣的觀點(diǎn)，指出PNU與α7nAChR結(jié)合，在大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)能夠激發(fā)全細(xì)胞電流〔14〕。通過動物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PNU能夠提高和改善認(rèn)知和記憶功能〔15〕。突觸前和突觸后受到干擾可以造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸傳遞和突觸可塑性的異常變化〔16〕。Syn與突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性調(diào)節(jié)密切相關(guān)，并且含有豐富的突觸前膜囊泡蛋白，在調(diào)節(jié)突觸小泡的循環(huán)和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放中扮演者重要的角色〔17〕。它可以反映突觸的密度和突觸的生成數(shù)量，因此，在研究中常常作為反映完整突觸的指標(biāo)。SNAP-25主要介導(dǎo)突觸囊泡的錨定及融合，且對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起著關(guān)鍵的作用；PSD95能夠與多種突觸后膜蛋白相互作用，參與突觸連接的形成和維持及突觸后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的完成。PSD-95 突觸后表達(dá)對突觸前終端的成熟具有促進(jìn)作用，同時也可以增加樹突棘的數(shù)量和大小，且 PSD95在突觸發(fā)育成熟和可塑性功能中也起到關(guān)鍵性作用〔18〕。本研究結(jié)果表明，α7nAChR在海馬組織中的表達(dá)量會影響突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，當(dāng)注射PNU282987的量達(dá)到1 mg/kg時，小鼠海馬中的突觸相關(guān)蛋白Syn、PSD-95、SNAP-25 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高，表明α7nAChR水平升高能增加突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，這可能提示α7nAChR在突觸功能中發(fā)揮著重要作用，對于神經(jīng)元突觸損傷有一定保護(hù)作用，α7nAChR可能通過增強(qiáng)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)提高和改善認(rèn)知和記憶功能，但其具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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