RP-HPLC法同時(shí)檢測新麥纖散中5種有效成分含量

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

麥纖散是浙江中醫(yī)藥大學(xué)鄭紅斌教授研究的一種治療潰瘍性結(jié)腸炎的經(jīng)驗(yàn)方[1]，新麥纖散復(fù)方制劑是在麥纖散（麥芽纖維、山藥、茯苓）的基礎(chǔ)上又配伍三七、白及所組成，主要針對潰瘍性結(jié)腸炎的瘀毒病機(jī)，進(jìn)一步改善患者腹痛、瀉下粘液膿血的癥狀，緩解腸道炎癥并縮短潰瘍愈合時(shí)間。其中的麥芽、山藥、茯苓是具有藥食兩用特性的天然藥物，治療脾胃病歷史悠久[2-4]。方中將麥芽列為君藥，山藥、茯苓為臣藥，以治本病脾虛之本；而又佐使以三七、白及解決其瘀毒之標(biāo)，全方共奏健脾固腸、止血愈瘍、消腫止痛、收斂生肌之效。

既往已有研究采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定三七中的三七皂苷R1和人參皂苷Rb1[5]、白及中的Coelonin[6]、山藥中的薯蕷皂苷[7]和茯苓中茯苓酸的含量[8]，但同時(shí)測定以上5種成分含量的方法尚未見于文獻(xiàn)報(bào)道。為了完善新麥纖散的質(zhì)量控制，有必要建立一種對多個(gè)中藥中多種成分的含量進(jìn)行同步分析的測定方法。本研究采用反相高效液相色譜技術(shù)（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）建立同時(shí)測定以上5種有效成分含量的方法，為完善新麥纖散的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器 Agilent1200高效液相色譜儀、G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管列陣檢測器（diode array detector，DAD）、G1311A 型四元泵、Agilent 1200色譜工作站均為美國 Agilent公司產(chǎn)品；AG135電子分析天平購于瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀購于昆山市超聲儀器有限公司；粉碎機(jī)購自廣州德章機(jī)械設(shè)備有限公司，Milli-Q超純水機(jī)為美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 試劑及藥品 甲醇（色譜純，購于德國MERCK公司，批號(hào)：20151016），乙腈（色譜純，購于德國MERCK公司，批號(hào)：20150921），甲醇（分析純，購于江蘇永華化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：20120409），磷酸（分析純，購于江蘇永華化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：20141102）。發(fā)酵的麥芽粗纖維購于蕭山啤酒廠，采用過濾槽法將麥汁（溶于水的浸出物）和麥糟（殘留的皮殼、高分子蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪等）分離；然后采用間接式加熱干燥法烘干后壓扁破碎，篩去皮殼，留取其中細(xì)粉部分，消毒干燥成型即得麥芽纖維，麥芽纖維純度測定參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]。山藥、茯苓、三七、白及4味中藥的4個(gè)批次藥物分別購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部、浙江中醫(yī)藥大學(xué)名中醫(yī)館、浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院名中醫(yī)館和胡慶余堂。標(biāo)準(zhǔn)對照品三七皂苷R1（批號(hào)：110703-201631）、人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-201625）、薯蕷皂苷（批號(hào)：111707-201402）、茯苓酸（批號(hào)：1110705201603）均購于中國藥品生物制品檢定所，Coelonin購于美國Sigma公司（批號(hào)：SMB00095）。

2 方法

2.1 色譜條件和色譜柱 采用phenomenex-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相采用乙腈和 0.1%磷酸水梯度洗脫；流速1.0mL/min；柱溫30℃；檢測波長為203nm，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Scratch elution program

2.2 溶液制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液的制備 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)對照品三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸各1.00mg，分別置于5mL容量瓶中，加一定量甲醇，搖勻，超聲使其完全溶解，放至室溫后加甲醇定容，得到三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)對照品單體溶液，濃度均為0.20mg·mL-1。再精密稱取標(biāo)準(zhǔn)對照品三七皂苷R1 3.25mg、人參皂苷 Rb1 2.10mg、Coelonin 0.40mg、薯蕷皂苷1.85mg、茯苓酸0.80mg，置于同一個(gè)5mL容量瓶，盡量使5種成分的比例與樣品中保持一致，然后加入一定量甲醇（分析純），搖勻，超聲使其完全溶解，放至室溫后加甲醇定容，得到三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)對照品混合溶液，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸濃度分別為 0.65mg·mL-1、0.42mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.37mg·mL-1、0.16mg·mL-1。將上述兩種溶液用 0.45μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用。

2.2.2 樣品溶液的制備 麥芽纖維、山藥、茯苓、三七、白及粉末按 3：2：2：1：1 比例混合后，用超微粉碎機(jī)粉碎并混合均勻，得到新麥纖散粉劑。精密稱取新麥纖散粉末3.00g，置于100mL錐形瓶中，加入甲醇60mL，超聲1h后室溫放置15min，取上清液，濾渣加30mL甲醇，超聲30minF口取上清液，合并兩次上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收，最終定容為5mL，用0.45μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 新麥纖散中薯蕷皂苷、茯苓酸、三七皂苷R1與人參皂苷Rb1、Coelonin分別來自中藥山藥、茯苓、三七、白及，根據(jù)新麥纖散處方組成比例，按照2.2.2樣品溶液的制備方法，分別配置缺山藥、缺茯苓、缺三七和缺白及的陰性樣品溶液，備用。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取標(biāo)準(zhǔn)對照品混合溶液、樣品溶液及各陰性樣品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)行進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10μL，記錄色譜圖。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察 取標(biāo)準(zhǔn)對照品混合溶液適量，甲醇稀釋定容，得到一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照品混合溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，記錄色譜圖。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取同一標(biāo)準(zhǔn)對照品混合溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣8次，進(jìn)樣量為10μL，記錄色譜峰面積。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精確稱取新麥纖散8份，每份3.00g，按2.2.2項(xiàng)制備方法平行制備樣品溶液8份，按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算各成分含量。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取制備好的同一樣品溶液，室溫放置，按2.1項(xiàng)色譜條件每2h進(jìn)樣一次，進(jìn)樣量為10μL，記錄三七皂苷 R1、人參皂苷 Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸的色譜峰面積。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的新麥纖散6份，每份1.50g，置于錐形瓶中，分別加入濃度為0.20mg·mL-1的三七皂苷 R1、人參皂苷 Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)對照品單體溶液4.00mL、11.50mL、0.30mL、1.90mL、0.86mL，按 2.2.2項(xiàng)制備方法制備成6份溶液備用，按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，記錄各色譜峰面積，計(jì)算各成分含量。樣品回收率（%）＝（測得量－樣品含量）/加樣量×100%。

2.9 樣品含量測定 分別精密稱取4個(gè)不同購買批次的新麥纖散每批各3份，每份3.00g，按2.2.2項(xiàng)制備方法制備樣品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，并記錄三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸的峰面積，計(jì)算各成分的含量。

3 結(jié)果

3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示樣品溶液色譜圖中出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)對照品混合溶液色譜圖中保留時(shí)間相一致的特征峰，分別為三七皂苷 R1、人參皂苷 Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸，而陰性樣品無此特征峰，表明其他組分對所測組分無干擾。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)本方法專屬性良好。見圖1、2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)對照品混合和新麥纖散樣品RP-HPLC結(jié)果Fig.1 RP-HPLC of mixing standard substance and new Maixiansan sample

圖2 陰性樣品RP-HPLC圖Fig.2 RP-HPLC of negative sample

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系考察 分別以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表2。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸的線性關(guān)系良好。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.2 Results of standard curve and linear relationship

3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 計(jì)算得三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為 1.12%、1.03%、0.98%、0.74%和0.77%。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)儀器精密度良好，RSD均不大于2%[9]。

3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 8次重復(fù)測定新麥纖散5種成分含量，結(jié)果見表3。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方法重復(fù)性良好（RSD不大于2%）[9]。

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸的峰面積RSD分別為：0.8662%、0.3481%、0.4402%、0.7065%、0.4756%。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)新麥纖散樣品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定（RSD不大于2%）[9]。

3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸的平均加樣回收率結(jié)果見表4。各成分回收率RSD值分別為1.27%、0.54%、0.53%、1.48%和0.81%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好（RSD不大于2%）[9]。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=8）Tab.3 Results of repetitive test(n=8)

4 討論

麥纖散是一種可以更好保護(hù)腸黏膜屏障，更有效改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和腸道微環(huán)境的中藥復(fù)方制劑[1]，新麥纖散則在此基礎(chǔ)上新增三七、白及，可更有效地

表4 三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸的平均加樣回收率（n=6）Tab.4 Sample recovery results of panax notoginseng saponins R1,ginsenoside Rb1,Coelonin,diosgenin and poria acid(n=6)

3.7 樣品含量的測定 結(jié)果顯示麥芽纖維與不同批次的山藥、茯苓、三七、白及組成的新麥纖散中三七針對潰瘍性結(jié)腸炎脾虛為本，瘀毒為標(biāo)的中醫(yī)病機(jī)。方中麥芽纖維可有效調(diào)整腸道免疫反應(yīng)，增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能，使黏膜的炎癥得以緩解[10]。三七具有免疫調(diào)節(jié)與抗炎活性，可對炎性反應(yīng)發(fā)生的多個(gè)環(huán)節(jié)，多種炎性介質(zhì)產(chǎn)生影響[11]。此外，三七皂苷能升高炎性細(xì)胞內(nèi)游離鈣的水平，降低磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）的活性，且能夠有效地釋放地諾前列酮從而達(dá)到抗炎作用[12]。李季委等[13]研究了薯蕷皂苷對潰瘍性結(jié)腸炎的作用，結(jié)果表明薯蕷皂苷能夠治療老年慢性潰瘍性結(jié)腸炎，具有一定的抗炎作用。黃斯等[14]發(fā)現(xiàn)茯苓酸對皮膚、口腔、耳道等局部炎癥有顯著抗炎作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明白及有止血、抗炎、抗腫瘤、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合及細(xì)胞生長等作用[15]。全方五種藥物相互配伍，達(dá)到健脾固腸，止血愈瘍之效。

表5 不同批次新麥纖散含量測定結(jié)果Tab.5 Results of four different batches of new Maixiansan content determination

雖然有文獻(xiàn)報(bào)道用高效液相色譜法分別測定三七中三七皂苷R1與人參皂苷Rb1[5]、白及中Coelonin[6]、山藥中薯蕷皂苷[7]和茯苓中茯苓酸的含量[8]，但由于提取條件及液相條件的限制，只能研究一種中藥中單一或少數(shù)成分，尚不能同時(shí)分析以上5種成分。目前文獻(xiàn)中關(guān)于麥芽纖維有效成分的液相色譜研究報(bào)道較少，而且缺少標(biāo)準(zhǔn)對照品，故本研究未做測定分析。筆者在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，提取條件中提取溶劑、提取方法和提取時(shí)間對新麥纖散中三七皂苷R1、皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸的含量很接近，結(jié)果見表5。人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、茯苓酸和Coelonin的含量測定有一定的影響。在選擇提取溶劑時(shí)，筆者曾采用甲醇、甲醇-水（9:1）、甲醇-水（5:5）、乙醇、乙醇-水（9:1）、乙醇-水（5:5）幾種不同的溶劑組合，結(jié)果顯示甲醇提取效果最好，提取有效成分更多，且操作簡便。在實(shí)驗(yàn)過程中筆者還發(fā)現(xiàn)，以甲醇作為提取溶劑并經(jīng)過超聲處理能夠進(jìn)一步提高提取效率，而甲醇的體積、超聲處理時(shí)間及提取次數(shù)對提取效果也有一定的影響，先加60mL甲醇超聲處理1h后過濾，濾渣再加30mL甲醇再次超聲處理1h能夠提取大量有效成分，這樣提取效率最高。因此筆者最終以甲醇為提取溶劑，超聲處理2次，每次1h，用于新麥纖散樣品的提取。

由于新麥纖散制劑中的藥物性味較多，其有效成分中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷屬于皂苷類化合物，茯苓酸屬于三萜類化合物、Coelonin則屬于菲類化合物，各成分之間存在一定的干擾，采用單一化合物的流動(dòng)相體系無法滿足5種待測成分同時(shí)分離測定的要求。在前期實(shí)驗(yàn)過程中，筆者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流動(dòng)相體系，結(jié)果表明單一流動(dòng)相各物質(zhì)分離效果不太理想，待測成分之間或待測成分與雜質(zhì)成分之間不能良好分離甚至無法分離。當(dāng)流動(dòng)相中的有機(jī)相為甲醇時(shí)，會(huì)出現(xiàn)基線不穩(wěn)、漂移等情況。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、茯苓酸和Coelonin的分離效果較好。

本研究建立的RP-HPLC法可同時(shí)測定新麥纖散中5種有效成分的含量，通過對4個(gè)批次藥物中5種有效成分含量的測定，發(fā)現(xiàn)不同批次的藥材中以上成分含量相差不大，并可較全面的反映市面上組成新麥纖散的藥材中成分的含量。本實(shí)驗(yàn)建立的方法與單獨(dú)測定某種成分含量的方法相比更簡便、快捷；且靈敏度高、選擇性好、能同時(shí)分析多種成分，可作為新麥纖散質(zhì)量評(píng)價(jià)方法之一，為新麥纖散質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為今后新麥纖散藥效學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)研究打下一定基礎(chǔ)，具有較重要的意義。

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