黃芪水提液對老年大鼠膀胱功能及組織學的影響

浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院 杭州 310005

我國人口老齡化問題日益突出，老年人尿路癥狀發(fā)生率不斷上升。流行病學調查顯示，下尿路癥狀（lower urinary tract symptoms,LUTS）發(fā)生率在老年人群中高達40%以上[1-2]，衰老所致的膀胱功能障礙是LUTS發(fā)生的重要危險因素[3]。衰老是膀胱功能異常的病理生理基礎，衰老膀胱的能量代謝、血流循環(huán)、膽堿能受體功能及膠原蛋白含量均發(fā)生了改變[4]，因此老年人更容易出現(xiàn)膀胱功能障礙。黃芪（Astragalus mongholicus Bunge）為豆科多年生草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，臨床常用于防治免疫功能紊亂性疾病、心腦血管疾病、衰老等多種疾病，療效確切且副作用較少[5]。鐘靈等[6]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可通過增強機體免疫功能、提高機體抗氧化能力和直接清除自由基等發(fā)揮延緩衰老的作用。本研究以老年大鼠為研究對象，探討黃芪水提液對老年大鼠膀胱功能的影響，為臨床應用提供依據(jù)。。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和飼養(yǎng)條件 雄性SPF級SD大鼠，3月齡10只，15月齡50只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證號：SYXK（滬）2013-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，濕度 50%～70%，采用 12h:12h晝夜間斷照明。每天添加飼料1次，換水2次，更換墊料2次。動物自由進食、飲水。

1.2 主要儀器 MedLab生物信號采集器購于南京美易生物科技有限公司，測壓導管由帶接頭的連續(xù)硬膜外麻醉導管改造而成；電動玻璃勻漿機為寧波新芝科器研究所產品；光學顯微鏡為日本尼康公司產品。

1.3 主要藥品及試劑 生黃芪選用蒙古黃芪，購自杭州胡慶余堂（批號：20061118）；維生素C片購自四川依科制藥有限公司（批號：H42020614）；維生素E軟膠囊購自浙江醫(yī)藥股份有限公司（批號：H22022955）。Masson三色染色液為南京凱基生物有限公司產品（批號：1111254681F）；20%烏拉坦購于杭州碧云天生物科技有限公司（批號：20080610）。

1.4 實驗藥物制備

1.4.1 黃芪水提液的制備 蒙古黃芪用干燥箱烘干24h，高速碎機粉碎后，過120目篩，制備成極細的黃芪粉末；以水作為溶劑進行浸提，浸提條件為90℃、30min，然后冷卻至室溫，過濾。濾液以5 000轉/min離心 10min，取上清液，調整生藥濃度為 0.4g·mL-1，放置4℃冰箱待用。

1.4.2 維生素E-C混懸液的制備 將維生素C片研碎，每150mg維生素C片和150mg維生素E混合溶解于1 000mL蒸餾水中，勻漿制成混懸液。

1.5 方法

1.5.1 分組與給藥 3月齡大鼠10只設為青年組（A）。15月齡自然衰老大鼠50只按數(shù)字編號，采用隨機對照表法隨機分為老年組（B）、維生素E-C混懸液組（C）、黃芪水提液低劑量組（D）、黃芪水提液中劑量組（E）、黃芪水提液高劑量組（F），每組10只。青年組和老年組大鼠均給予0.9%氯化鈉溶液（20mL·kg-1）灌胃，1次/d，連續(xù)6周。臨床上體重60kg成人黃芪常用量為9～30g，最高劑量可達到90g，根據(jù)實驗動物學及中藥藥理學，大鼠用藥劑量按照60kg成人用量的6.3倍進行計算，黃芪水提液低、中、高劑量組分別給予2g·kg-1、4g·kg-1、8g·kg-1灌胃；維生素 E-C 混懸液組則給予維生素E-C混懸液（5mg·kg-1）灌胃，均為1次/d，連續(xù)6周。

1.5.2 大鼠膀胱內壓與膀胱容量測定 參照鄺兆進[7]的實驗方法進行。具體如下：大鼠用20%烏拉坦溶液（0.5mL·100g-1）腹腔注射麻醉后，沿下腹正中線切開皮膚和肌肉，暴露膀胱。以濕潤棉花稍加固定，用眼科鑷子輕提膀胱，用4.5號頭皮針針頭在膀胱頂部刺一小孔，然后用1號線將針頭稍加固定，并與三通管的一路相連，三通管的另兩路分別連接壓力換能器和注射泵，整個系統(tǒng)用0.9%氯化鈉溶液密閉。打開MedLab生物信號采集器，記錄膀胱基礎內壓（bladder basal pressures，BP)，隨后開啟注射泵，按 0.2mL·min-1持續(xù)泵入0.9%氯化鈉溶液并記錄壓力變化。排尿時，停止泵入0.9%氯化鈉溶液，液體溢出時記錄的膀胱壓即為膀胱漏尿點壓（bladder leak point pressures，BLPP），同時收集排尿量（urination volume，UV），待排尿結束后，用注射器抽空膀胱內殘余尿量（residual urine volume,RUV），最后可計算最大膀胱容量（total urine volume,TUV）,TUV=UV+RUV。排空膀胱，再次灌注至膀胱最大容量一半時，用手指緩緩按壓大鼠上腹部使腹壓逐漸上升，觀察有無尿液從尿道外口溢出，若有尿液溢出，此時記錄的膀胱壓即為腹壓漏尿點壓（abdomen leak point pressure，ALPP）。見圖 1、圖2。

1.5.3 大鼠膀胱組織Masson染色 待測壓結束后，立即處死大鼠，剪取膀胱組織，采用預冷0.9%氯化鈉溶液沖洗后，浸泡于4%多聚甲醛中保存。常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟至水。在載玻片上滴加1滴蘇木素染色液（試劑A），常溫下染色7min，蒸餾水沖掉染液。滴加1滴復合染色液（試劑B），常溫下染色5min，蒸餾水沖洗掉染液。滴加1滴磷鉬酸（試劑C），常溫下染色1min，蒸餾水沖洗掉染液。滴加1滴亮綠染色液（試劑D），染色10s后用蒸餾水沖洗。最后將玻片放入60℃烘箱中烘干，中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取5個視野，通過IPP6.0計算機圖像分析系統(tǒng)，測出每個視野膠原纖維所占的面積百分比，5個視野面積百分比的平均值為該組織切片膠原纖維所占的面積百分比，即膠原纖維占比。

圖1 BLPP測定曲線圖Fig.1 Bladder pressure leak point pressure curve

圖2 ALPP測定曲線圖Fig.2 Abdominal pressure leak point pressure curve

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示；兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義時采用LSD-t檢驗進一步兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠膀胱容量的比較 灌胃6周后，與青年組相比，老年組大鼠RUV和TUV明顯增加（P＜0.05）。與老年組大鼠相比，維生素E-C混懸液組和黃芪水提液各劑量組大鼠RUV明顯減少，而TUV明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）；其中黃芪水提液各劑量組作用存在劑量依賴性，與老年組相比，高劑量組變化最明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

2.2 各組大鼠膀胱壓力的比較 灌胃6周后，與青年組相比，老年組大鼠BLPP、ALPP明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與老年組比較，維生素EC混懸液組和黃芪水提液各劑量組BLPP、ALPP顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.3 各組大鼠膀胱組織纖維化情況的比較 Masson染色鏡下觀察可見，青年組大鼠逼尿肌排列整齊，膠原纖維（深染部分）較少。與青年組相比，老年組大鼠膀胱組織中逼尿肌纖維排列紊亂，松散，膠原纖維占比明顯增加（P＜0.05）；與老年組相比，黃芪水提液中劑量組和高劑量組的膀胱組織膠原纖維占比減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5、表1。

圖3 各組大鼠膀胱殘余尿及總尿量的比較Fig.3 Comparison of residual urine and total urine volume in each group

圖4 各組大鼠膀胱BLPP及ALPP的比較Fig.4 Comparison of BLPP and ALPP in each group

3 討論

引發(fā)老年人排尿功能改變的因素除了神經、血管系統(tǒng)病變和膀胱流出道梗阻外，衰老本身也是重要因素之一[8]。研究證實，膀胱功能改變與年齡密切相關，老年人群（年齡＞60歲）膀胱容量較青年人群（年齡＜40歲）明顯增加，而膀胱逼尿肌收縮功能和漏尿點壓力明顯降低[9]。本研究中老年組大鼠膀胱TUV和RUV均較青年組顯著增加，提示老年大鼠存在膀胱排空功能障礙。引起這一變化最常見的原因是逼尿肌收縮能力和膀胱容量敏感性的降低。Smith等[10-11]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)患者晨起第一次排尿量隨著年齡的增加而逐漸增加，進一步印證了衰老與膀胱容量敏感性降低相關。本實驗中同時觀察到大鼠膀胱內壓隨著年齡的增加而降低，提示老年大鼠膀胱逼尿肌收縮功能的下降。衰老還可導致膀胱組織結構發(fā)生改變，如Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠膀胱逼尿肌收縮功能的下降與膀胱壁組織中平滑肌成分的比例降低及膠原成分比例提高相關。本研究也發(fā)現(xiàn)，老年組大鼠膀胱組織中膠原纖維占比較青年組明顯增加。平滑肌/膠原比例失衡，可能是引起老年大鼠膀胱功能障礙的結構基礎。衰老導致膀胱結構和功能的改變潛在機制復雜，受到遺傳、環(huán)境等多因素的影響，仍需進一步深入研究。

維生素C和維生素E分別是水溶性和脂溶性的抗氧化維生素，具有較強的抗氧化作用，能發(fā)揮獨特的抗衰老功效[13]。動物實驗證實，維生素C和維生素E聯(lián)合使用可明顯增加大鼠肝臟和肌肉中過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶的活性，而且效果比兩者單獨作用更顯著[14]。維生素C和維生素E對于膀胱衰老的干預也有研究報道，維生素E在早期糖尿病大鼠膀胱氧化性損傷中能夠發(fā)揮抗氧化作用[15]，并能增加老年大鼠膀胱組織中還原型谷胱甘肽水平，也能對膀胱功能起到保護作用[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)，兩者合用雖然不能顯著改善老年大鼠膀胱組織纖維化，但是能顯著增加老年大鼠膀胱內壓，提高膀胱逼尿肌的收縮功能，進而減少膀胱殘余尿量，改善排尿功能。

圖5 各組大鼠膀胱組織纖維化情況的比較（Masson染色，100×）Fig.5 Comparison of fibrosis of bladder tissue in each group（Masson staining 100×）

表1 黃芪水提液對大鼠膀胱組織膠原纖維占比的影響（%）Tab.1 Effect of Astragalus aqueous extract on histology of bladder detrusor in rats(%)

祖國醫(yī)學寶庫中有許多具有抗衰老作用的藥材，黃芪作為名貴的補益藥，其藥效已獲得廣泛的認同。動物實驗從不同角度證實了黃芪提取物及其有效成分具有抗氧化，抗氧自由基損傷的作用，從而延緩機體器官衰老[17-18]。另外，黃芪能夠調節(jié) p16、Bcl-2、FasL等基因的表達，從而抑制細胞凋亡，保護細胞功能，延緩衰老[19-20]。馮建華等[21]采用黃芪干預糖尿病大鼠模型，證實其對糖尿病大鼠膀胱功能具有保護作用。黃芪水提液制備簡單，其中起到抗衰老作用的主要是水溶性的黃芪多糖、黃酮、皂苷等成分[22]。楊小虎等[23]采用體外實驗證實黃芪水提液具有良好的自由基清除效果，以達到抗衰老功效。本研究中黃芪以成人臨床常用劑量范圍做參考，根據(jù)實驗動物學及中藥藥理學換算成3個不同劑量組進行大鼠給藥，結果發(fā)現(xiàn)不同劑量黃芪水提液均能降低老年大鼠殘余尿量，增加膀胱BLPP和ALPP，除低劑量組外均能降低膀胱組織膠原纖維占比，抑制纖維化，進而提高膀胱逼尿肌收縮功能，改善排尿功能。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪水提液對衰老所致膀胱功能障礙有明顯改善作用，今后筆者將就黃芪改善老年膀胱功能的機制進一步深入研究，為中藥黃芪防治膀胱功能障礙提供新的理論依據(jù)。

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