煙草黑脛病拮抗細(xì)菌的篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化

尹福強(qiáng)　劉銘　蔡藝梅

摘要：為獲得對(duì)煙草黑脛病有較強(qiáng)生防效果的拮抗細(xì)菌，從四川省涼山州5個(gè)縣（市）煙草種植田地采集10份土壤樣品，通過(guò)稀釋平板法分離得到112株細(xì)菌。采用平板對(duì)峙法獲得39株對(duì)煙草黑脛病病原菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）拮抗效果較好的細(xì)菌。選取拮抗效果最好的GC-38菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究，結(jié)果顯示，菌株GC-38對(duì)煙草黑脛病病菌抑制率為81.81%，經(jīng)鑒定菌株GC-38為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliauefaciens）。優(yōu)化后得到其最佳發(fā)酵條件：碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，pH值為9.0，溫度在30～35 ℃范圍內(nèi)?？梢姡珿C-38菌株對(duì)煙草黑脛病有明顯的拮抗作用，是具有較大開發(fā)潛能的生防菌株。

關(guān)鍵詞：煙草黑脛??；拮抗細(xì)菌；抑菌率；發(fā)酵條件；生物防治

中圖分類號(hào)： S435.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）15-0096-03

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，近年來(lái)，煙草黑脛病逐漸成為僅次于煙草病毒病的第二大煙草病害，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失平均均為1億元[1-2]。煙草黑脛病是由煙草疫霉（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引發(fā)的經(jīng)土壤傳播的真菌性病害，主要發(fā)生在煙草成株階段，在苗床期發(fā)生較少，煙草黑脛病常年發(fā)病率為10%～15%，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率高于80%，甚至絕收，給煙草生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的威脅。

對(duì)煙草黑脛病的防治，目前主要集中在化學(xué)防治方面[3]。但化學(xué)防治可造成環(huán)境污染，且容易產(chǎn)生抗藥性[4]。相對(duì)于化學(xué)防治而言，生物防治具有成本低、有效期長(zhǎng)、不污染環(huán)境、對(duì)人畜安全、病害不易產(chǎn)生抗性、可減少化學(xué)農(nóng)藥用料、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)。本研究從煙草根際土壤中分離篩選出有益細(xì)菌，篩選拮抗效果較好的菌株，然后對(duì)其進(jìn)行鑒定，研究其生長(zhǎng)曲線及發(fā)酵條件，為更好地利用該菌株奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為黑脛病的生物防治提供資源。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌種

煙草疫霉（P.parasitica var. nicotianae），由西昌學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2供試土壤樣品

采自四川省涼山州會(huì)理縣、普格縣、鹽源縣、冕寧縣、西昌市5個(gè)縣（市）煙草黑脛病發(fā)病嚴(yán)重的健康煙草植株的根際土壤。

1.1.3供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、NA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方均參照《微生物及其應(yīng)用》[5]。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1拮抗細(xì)菌的分離

采用稀釋平板法分離拮抗細(xì)菌。在健康煙草植株的根際采集土壤樣品，采用5點(diǎn)法取樣，每點(diǎn)取20 g土壤樣品，每塊煙田中共取100 g土壤樣品。5個(gè)縣（市）的取樣點(diǎn)共取10份土壤樣品，分別將每份土壤樣品充分混勻后稱取10 g裝入10個(gè)三角瓶中，并加入適量提前滅菌的玻璃珠和90 mL無(wú)菌水，將三角瓶振蕩20 min，靜置 5 min 后取其上清液。最后用無(wú)菌水將上清液稀釋成濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8懸浮液，本試驗(yàn)取用10-6、10-7、10-8懸浮液，在超凈工作臺(tái)上用三角玻璃棒將上清液均勻涂抹于NA平板上，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)1～2 d。待菌落長(zhǎng)出后，將單菌落逐個(gè)挑出轉(zhuǎn)接于試管中，進(jìn)行純化培養(yǎng)并編號(hào)。

1.2.2拮抗細(xì)菌的篩選

以煙草黑脛病病菌作為病原菌，采用對(duì)峙劃線法測(cè)定拮抗細(xì)菌對(duì)病原菌的拮抗作用，用直徑為 5 mm 的打孔器打取病原菌菌餅，接種于PDA平板中心，用接種環(huán)挑取供試拮抗細(xì)菌于距平板中央約3 cm處劃1條貫穿培養(yǎng)皿的菌線，以接種病原菌菌餅不接拮抗菌的PDA平板作為對(duì)照，在28 ℃恒溫培養(yǎng)，產(chǎn)生抑菌效果后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落半徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照組病原菌菌落半徑-處理組病原菌菌落半徑）/對(duì)照組病原菌菌落半徑×100%。

選出對(duì)病原菌有拮抗效果的菌株，再以相同的方法進(jìn)行復(fù)篩，每個(gè)菌株3次重復(fù)，從中選出拮抗效果最好的1株菌株，用于發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.3拮抗細(xì)菌的鑒定

采用劃線培養(yǎng)法將篩選出的拮抗效果最好的細(xì)菌菌株接種至NA平板上，35 ℃倒置培養(yǎng)1～2 d，通過(guò)細(xì)菌的形態(tài)特征及生理生化特征進(jìn)行初步鑒定。鑒定方法參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[6]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]。

1.2.4拮抗細(xì)菌菌株種子液制備

從篩選出的拮抗效果最好的細(xì)菌菌株斜面上挑取1環(huán)培養(yǎng)物接種于50 mL NA液體培養(yǎng)基中，于35 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)12 h得到拮抗細(xì)菌種子液。

1.2.5生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將細(xì)菌菌株種子液以4 mL的接種量接入250 mL的NA液體培養(yǎng)基中，35 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48 h取出2 mL培養(yǎng)液測(cè)其D600 nm，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6發(fā)酵條件優(yōu)化

NA培養(yǎng)基中分別含有蛋白胨和葡萄糖，為使發(fā)酵條件得到優(yōu)化可以在其他培養(yǎng)基配方不變的基礎(chǔ)上，分別用其他可用氮源、碳源將蛋白胨、葡萄糖換掉。本試驗(yàn)?zāi)軌蚴褂玫牡从邢跛徜@、硝酸鉀、氯化銨和硝酸鈉，可使用的碳源有蔗糖、可溶性淀粉、乳糖和麥芽糖。通過(guò)對(duì)氮源、碳源的更換分別制成了不同氮源、碳源的培養(yǎng)基。改變溫度、pH值，以4 mL的接種量將種子液接入到250 mL不同培養(yǎng)基中，140 r/min振蕩培養(yǎng)，測(cè)其D600 nm，得到拮抗細(xì)菌的最適發(fā)酵條件。

2結(jié)果與分析endprint

2.1煙草黑脛病根際拮抗細(xì)菌的篩選

用稀釋平板法分離并得到了112株細(xì)菌，采用平板劃線對(duì)峙法分別接種病原菌和細(xì)菌。首先取5 mm病原菌菌餅接種于PDA平板中央，再用劃線法在距平板中心約3 cm處將細(xì)菌接種于平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)6 d后觀察抑菌效果，計(jì)算抑菌率。由表1可知，有抑菌作用的菌株共39株，占3482%，這39株拮抗菌對(duì)病原菌的平均抑制率為64.57%，拮抗效果最好的菌株是GC-38，其抑菌率高達(dá)81.81%。

2.2菌株GC-38的鑒定

GC-38菌株在NA培養(yǎng)基上菌落為乳白色至淡黃色，菌落直徑2～3 mm，圓形，周圍不規(guī)則，表面不光滑，有皺紋。顯微鏡下觀察，菌體呈桿狀，直或接近直，（0.3～2.2） μm×（1.2～7.0） μm，多數(shù)運(yùn)動(dòng)，鞭毛典型側(cè)生。由表2可知，GC-38菌株的革蘭氏染色、葡萄糖、蔗糖、氧化酶、接觸酶、淀粉水解、硝酸鹽還原、甲基紅、伏-普反應(yīng)（V-P）、明膠液化和檸檬酸鹽試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，而吲哚、乙醇氧化、乙酸試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。菌株GC-38的形態(tài)及生理生化特性與解淀粉芽孢桿菌最為接近，經(jīng)鑒定，GC-38為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliauefaciens）。

2.3生長(zhǎng)曲線的繪制

由圖1可知，GC-38菌株的生長(zhǎng)曲線基本呈“S”形，0～12 h 其生長(zhǎng)較為平緩，為延遲期；12～33 h菌株生長(zhǎng)相對(duì)于 0～12 h要快很多，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在33～42 h菌株基本停止生長(zhǎng)，為穩(wěn)定期；42 h后菌株不再生長(zhǎng)甚至出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象，此時(shí)為衰亡期。該菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)迅速，代謝比較強(qiáng)，生命力強(qiáng)，最適合用作種子液，因此，選取12 h時(shí)的發(fā)酵液作為種子液。

2.4GC-38菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1pH值對(duì)GC-38菌株生長(zhǎng)的影響

將GC-38菌株的種子液按4 mL的接種量分別接種于初始pH值分別為6、7、8、9、10、11、12，裝液量為250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 140 r/min、35 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)20 h，測(cè)定其D600 nm。由圖2可知，pH值為9時(shí)，GC-38菌株的D600 nm最高，即菌株生長(zhǎng)量較大。因此，GC-38菌株發(fā)酵的最適pH值為9。

2.4.2溫度對(duì)GC-38菌株生長(zhǎng)的影響

將GC-38菌株的種子液按4 mL的接種量接種到250 mL、pH值為9的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別在15、20、25、30、35、40、45 ℃條件下，140 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，測(cè)定其D600 nm。由圖3可知，溫度為30～35 ℃時(shí)，GC-38菌株的生長(zhǎng)量較大，因此，最適溫度范圍為30～35 ℃。

2.4.3碳源篩選

將GC-38菌株的種子液按4 mL的接種量接種到250 mL、pH值為9的碳源培養(yǎng)基中，140 r/min、35 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)20 h，稀釋20倍測(cè)定其D600 nm。由圖4可知，以葡萄糖為碳源對(duì)GC-38菌株生長(zhǎng)量的作用最大，因此，確定最適碳源為葡萄糖。

[TPYFQ4.tif]

2.4.4氮源篩選

將GC-38菌株的種子液按4 mL的接種量，接種到250 mL、pH值為9的氮源培養(yǎng)基中，140 r/min、35 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)20 h，測(cè)定其D600 nm。由圖5可知，蛋白胨為氮源時(shí)菌株的D600 nm最高，即菌株生長(zhǎng)量最大，因此，確定最適氮源為蛋白胨。

3討論

20世紀(jì)90年代以來(lái)，越來(lái)越多的人開始關(guān)注生物防治，用于生物防治的微生物有很多，主要包括真菌、細(xì)菌、放線菌、病毒等。易龍等從煙草病株提取出對(duì)煙草赤星病病菌有明顯抑制作用的拮抗內(nèi)生細(xì)菌Ttb162[8]。劉鑫海等從甜瓜表面分離得到的假單胞菌對(duì)甜瓜枯萎病的生防效果較好[9]。唐圣華等從煙草根際土壤中分離得到的1株枯草芽孢桿菌對(duì)煙草赤星病有較好的防效[10]。

近年來(lái)，芽孢桿菌用于病害防治的研究較多，某些芽孢桿菌不僅能防病而且在防病的同時(shí)還能促進(jìn)作物的生長(zhǎng)，使作物的產(chǎn)量得到顯著的增加[11-12]。朱曉飛等從土壤中篩選出的解淀粉芽孢桿菌對(duì)水稻紋枯病的抑制率高于70%[13]。本研究篩選的GC-38解淀粉芽孢桿菌對(duì)煙草黑脛病具有較好的抑菌活性，這在此前還未見報(bào)道，但解淀粉芽孢桿菌對(duì)煙草黑脛病病原菌的抑制機(jī)理及大田防治效果還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]孔凡玉，朱賢朝. 我國(guó)煙草侵染性病害發(fā)生趨勢(shì)原因及防治對(duì)策[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，1995（1）：31-34.

[2]陳瑞泰，朱賢朝. 全國(guó)16個(gè)主產(chǎn)煙?。▍^(qū)）煙草侵染性病害調(diào)研報(bào)告[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，1997，18（4）：1-7.

[3]李勇，朱曉偉，張定志. 幾種藥劑防治煙草黑脛病田間試驗(yàn)[J]. 植物醫(yī)生，2012（1）：35-37.

[4]袁宗勝，張廣民，劉延榮，等. 煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的敏感性測(cè)定[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2001，22（4）：9-12.

[5]秦春娥，別運(yùn)清. 微生物及其應(yīng)用[M]. 武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2008.

[6]布坎南 R E，吉本斯 N E. 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 8版.北京：科學(xué)出版社，1984.

[7]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[8]易龍，肖崇剛，馬冠華，等. 防治煙草赤星病有益內(nèi)生細(xì)菌的篩選及抑菌作用[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2004，44（1）：19-22.

[9]劉鑫海，王祺，周洪友. 甜瓜采后病害生防細(xì)菌的鑒定及生理生化特性測(cè)定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（3）：185-189.

[10]唐圣華，萬(wàn)秀清，郭兆奎，等. 煙草赤星病拮抗生防菌BS06-1的篩選[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（35）：15564-15565.

[11]陳中義，張杰，黃大昉. 植物病害生防芽孢桿菌抗菌機(jī)制與遺傳改良研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2003，33（2）：97-103.

[12]范瑛閣，李莎，趙靜，等. 枯草芽孢桿菌H1和H2對(duì)黃瓜的促生作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（7）：158-161.

[13]朱曉飛，張曉霞，牛永春，等. 一株抗水稻紋枯病菌的解淀粉芽胞桿菌分離與鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2011，51（8）：1128-1133.endprint