豁痰解毒通絡(luò)飲干預(yù)NF—κB/ERK信號(hào)通路參與球囊損傷后大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生的機(jī)制研究

沈娟娟+鄧悅+路方平+馬金玲+田野+王聞靖+張冰銳

【摘要】目的 研究觀察豁痰解毒通絡(luò)方對(duì)頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后再狹窄大鼠，主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制和相關(guān)指標(biāo)。方法 采用SD大鼠建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷動(dòng)物模型；隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、豁痰解毒通絡(luò)組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡(luò)組+辛伐他汀組。采用免疫組化法檢測(cè)大鼠頸動(dòng)脈組織ERK、NF-κB蛋白的表達(dá)。結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果提示：假手術(shù)組無(wú)陽(yáng)性著色。模型組可見(jiàn)較多棕黃色細(xì)胞核。豁痰解毒通絡(luò)組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡(luò)+辛伐他汀組陽(yáng)性著色與模型組比較顯著改善。結(jié)論 豁痰解毒通絡(luò)飲可以有效抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的增殖，可能通過(guò)抑制ERK1/2、NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制新生內(nèi)膜的增殖。

【關(guān)鍵詞】豁痰解毒通絡(luò)；PTCA術(shù)后再狹窄；血管重構(gòu)；細(xì)胞增殖

【中圖分類號(hào)】R28 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2017.32..02

心血管疾病目前已成為威脅人類健康與生命的頭號(hào)殺手，其發(fā)病率和死亡率超過(guò)腫瘤性疾病躍居第一[1]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）后再狹窄（restenosis，RS）是影響冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病介入治療預(yù)后的關(guān)鍵問(wèn)題，嚴(yán)重制約了經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）的遠(yuǎn)期療效，成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。隨著對(duì) RS 分子水平機(jī)理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)許多因素如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等可通過(guò)活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)氨基末端蛋白激酶（JNK）、p38 絲裂素活化蛋白激酶（p38 MAPK）信號(hào)通路影響細(xì)胞周期蛋白及凋亡相關(guān)基因，在 VSMC 增殖、分化、凋亡以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3-4]。針對(duì)PTCA后再狹窄，VSMC 增殖與凋亡調(diào)控因素的干預(yù)是 RS 防治的切入點(diǎn)。近年來(lái)，中醫(yī)藥防治PTCA后再狹窄的研究漸趨活躍。中藥具有穩(wěn)定性好，毒副作用小等特點(diǎn)，己經(jīng)越來(lái)越受到人們關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠60只，50日齡，重量（350±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 藥品與試劑

中藥：豁痰解毒通絡(luò)飲：雙花，當(dāng)歸，甘松，丹參等藥物組成。生藥由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，含生藥量為2.33 g/mL。辛伐他汀片（遠(yuǎn)大醫(yī)藥中國(guó)有限公司，批號(hào)：H20000107，規(guī)格：5 mg）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

迷你轉(zhuǎn)印電泳儀（北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司，DYCZ-24D）；低速水平離心機(jī) （湖南相依離心機(jī)儀器有限公司，L-550）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。術(shù)前背部皮下注射低分子肝素鈉注射液，預(yù)防急性血栓形成，劑量為500 U/kg。注射1 h后進(jìn)行造模。腹腔麻醉大鼠。固定大鼠取正中切口，分離并且暫時(shí)阻斷左頸總動(dòng)脈、左側(cè)頸外動(dòng)脈、左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎小分支。在左頸總動(dòng)脈近心端采用動(dòng)脈夾暫時(shí)阻斷后，于頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用眼科剪一小切口，在導(dǎo)絲引導(dǎo)下插入3.0×15 mmRunjin球囊導(dǎo)管，迅速插入球囊導(dǎo)管，緩慢伸至頸總動(dòng)脈近心端處，導(dǎo)管插入深度約4 cm，采用醫(yī)用球囊擴(kuò)張壓力泵（l～2 atm）充盈球囊，以生理鹽水充盈球囊（壓力0.6～0.8 atm），持續(xù)30 s后，使球囊膨脹至回拉時(shí)有較明顯的阻力感，保持阻力一致緩慢向遠(yuǎn)心端旋轉(zhuǎn)回拉，球囊至頸總動(dòng)脈分叉處，將球囊泄壓至0 atm，再次重復(fù)以上步驟，反復(fù)操作3次。撤出球囊后，迅速結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈，開(kāi)通頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈血運(yùn)循環(huán)，分層縫合頸部傷口。術(shù)后腹腔注射青霉素抗炎，背部皮下注射低分子肝素鈉注射液抗凝3天。假手術(shù)組大鼠只分離并結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈，不做球囊拉傷處理。

1.2.2 分組給藥

于術(shù)后第2天起連續(xù)灌胃30天。假手術(shù)組、模型組灌胃等量蒸溜水，豁痰解毒通絡(luò)組灌胃豁痰解毒通絡(luò)方1.633 g/mL。辛伐他汀組灌胃辛伐他汀0.119 mg/mL?；硖到舛就ńj(luò)方+辛伐他汀組灌胃豁痰解毒通絡(luò)方1.633 g/mL及辛伐他汀0.119 mg/mL。每日1次，給藥30天。

1.2.3 免疫組化染色法檢測(cè)大鼠頸動(dòng)脈ERK、NF-kB的表達(dá)

常規(guī)脫蠟至水洗，檸檬酸鹽熱修復(fù)，然后室溫冷卻；清洗；滴加阻斷劑，清洗；加封閉液；滴加一抗（ERK抗體效價(jià)1：100、NF-κB抗體效價(jià)1：100），4℃靜置過(guò)夜；清洗；滴加生物素標(biāo)記的抗鼠/兔IgG的第二抗體，清洗；滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白，清洗；滴加顯色劑，光鏡下觀察，顯色適當(dāng)用水終止；Mayer蘇木素復(fù)，蒸餾水沖洗；弱氨水返藍(lán)，蒸餾水沖洗；脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%），例（n）表示，采用x2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以“x±s”表示，采用t檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色法檢測(cè)大鼠頸動(dòng)脈NF-κB的表達(dá)

NF-κB通常狀況下存在于胞漿，活化后進(jìn)入核內(nèi)，免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞核呈棕黃色，并可見(jiàn)棕黃色顆粒沉積。假手術(shù)組無(wú)陽(yáng)性著色。球囊損傷術(shù)后30天模型組和假手術(shù)組可見(jiàn)血管壁新生內(nèi)膜細(xì)胞較多棕黃色細(xì)胞核?；硖到舛就ńj(luò)組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡(luò)+辛伐他汀組陽(yáng)性著色與模型組比較顯著改善。

2.2 免疫組化染色法檢測(cè)大鼠頸動(dòng)脈ERK的表達(dá)endprint

p-ERK通常狀況下存在于胞質(zhì)，活化后進(jìn)入核內(nèi)，免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞核呈棕黃色，并可見(jiàn)棕黃色顆粒沉積。假手術(shù)組無(wú)陽(yáng)性著色。球囊損傷術(shù)后 30 天模型組和假手術(shù)組可見(jiàn)明顯棕黃色細(xì)胞核?；硖到舛就ńj(luò)組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡(luò)+辛伐他汀組陽(yáng)性著色與模型組比較顯著改善。

3 討 論

由于球囊反復(fù)、持續(xù)對(duì)血管壁進(jìn)行刺激，受累血管壁細(xì)胞不斷激活炎性等刺激因子逐漸形成慢性炎癥。由于刺激因子持續(xù)存在，在其長(zhǎng)期刺激引導(dǎo)下炎性因子表達(dá)增高[5]。在其外力持續(xù)刺激下血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，致內(nèi)膜不斷增生，進(jìn)一步血管重塑形成血管再狹窄。

在慢性炎癥過(guò)程中，損傷的血管平滑肌細(xì)胞可釋放大量活性物質(zhì)，這與中醫(yī)所述病理性津液滯留所致“痰”的理論一致[6]。而慢性炎癥過(guò)程中血小板黏附、聚集及血栓的產(chǎn)生、纖維斑塊及結(jié)締組織的形成、單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞在內(nèi)皮下的沉積、血液粘稠度增高等現(xiàn)象，又符合中醫(yī)“瘀”的具體表現(xiàn)[7]。中醫(yī)認(rèn)為，“痰”與“瘀”常共同致病，痰瘀互結(jié)，蘊(yùn)結(jié)成毒，“毒”損脈絡(luò)，加重血管的損傷。

我們根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)RS發(fā)生發(fā)展的新認(rèn)識(shí)，以“伏邪多與痰瘀相關(guān)”為突破口，提出“痰瘀互結(jié)，毒損心絡(luò)可能是PTCA術(shù)后再狹窄主要機(jī)制”假說(shuō)。治療應(yīng)以“豁痰解毒，化瘀通絡(luò)”為治療原則。探討豁痰解毒通絡(luò)飲干預(yù)RS后內(nèi)膜增生的作用機(jī)制，從而達(dá)到防治血管再狹窄目的。因此，我們確立以“痰瘀互結(jié)，毒損心絡(luò)”為切入點(diǎn)，以豁痰解毒，化瘀通絡(luò)為治療原則，探討中藥復(fù)方通過(guò)干預(yù)炎癥反應(yīng)防治RS的作用機(jī)制。對(duì)明確了解中醫(yī)藥干預(yù)RS其作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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本文編輯：李 豆endprint