烯丙基絲素蛋白溫敏水凝膠的合成及性能研究

王勃翔，劉麗，李佳，路艷華，程德紅，靳惠宇，周凌

（1 上海大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海200444； 2 遼東學(xué)院遼寧省功能紡織材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧丹東118003）

引 言

水凝膠是一種具有三維交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的材料，它在水中溶脹而不溶解，并能夠吸收超過(guò)自身體積數(shù)百倍乃至數(shù)千倍的水分，是集吸水、保水、緩釋、柔性等特點(diǎn)于一體的新型材料[1]。水凝膠因其高含水量和仿真的組織彈性，已經(jīng)成為體外細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程和藥物載體的理想材料。水凝膠可以模擬細(xì)胞外天然基質(zhì)，并且可調(diào)節(jié)的力學(xué)性能有助于保持水凝膠結(jié)構(gòu)的完整性和細(xì)胞的黏附性[2]。目前開發(fā)的水凝膠很少作為單一組分獨(dú)立調(diào)整細(xì)胞生態(tài)環(huán)境，因此，引入天然蛋白質(zhì)能夠?yàn)樗z提供高的生物仿生特性和豐富的生物活性位點(diǎn)。

蛋白質(zhì)具有長(zhǎng)程有序的二級(jí)分子結(jié)構(gòu)和高一級(jí)氨基酸序列，展現(xiàn)出獨(dú)特的生物結(jié)構(gòu)和生物活性，蛋白質(zhì)材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。柞蠶絲是一種常見的非?？菩Q絲，絲素蛋白（ASF）為柞蠶絲纖維的主要成分[3]。ASF 中含有特有的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸RGD 序列，RGD 序列可與哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生特異相互作用，可與11種整合素特異性結(jié)合，有利于細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)，具有其他蛋白質(zhì)所不可比擬的生物親和性。目前，以ASF 制成的生物醫(yī)用和組織工程材料如凝膠材料、納米纖維膜、支架和薄膜材料等[4-7]已經(jīng)得到廣泛的研究。但是，由于ASF 再生的過(guò)程中溶劑對(duì)其大分子結(jié)構(gòu)以及結(jié)晶結(jié)構(gòu)的破壞，獨(dú)立制成的材料缺乏一定的力學(xué)強(qiáng)度和機(jī)械穩(wěn)定性，難以形成特定形狀的材料；而且ASF 大分子肽鏈上缺乏一定的活性位點(diǎn)，與高分子聚合物復(fù)合相容性較差，嚴(yán)重影響其實(shí)際使用性能，限制其作為生物醫(yī)用材料的發(fā)展[8-11]。環(huán)氧化合物常被用來(lái)改性蠶絲纖維，通過(guò)環(huán)氧化合物對(duì)真絲進(jìn)行整理，在真絲織物泛黃、耐老化性和抗褶皺性等方面取得了良好的效果[12]。烯丙基縮水甘油醚（AGE）是一種含不飽和雙鍵和環(huán)氧基雙官能團(tuán)的功能分子，易溶于水，其環(huán)氧基團(tuán)能夠與絲素蛋白中的組氨酸、賴氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸和酪氨酸發(fā)生反應(yīng)[13]。因此，AGE 的環(huán)氧基團(tuán)可以與ASF 上大量的氨基發(fā)生反應(yīng)，從而可將雙鍵引入到ASF主鏈上，形成具有反應(yīng)性的ASF，為其與烯丙基單體共聚提供有利條件。

近年來(lái)，智能響應(yīng)性材料受到廣泛的關(guān)注和研究。智能水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)的開發(fā)中能夠?qū)?xì)胞增殖情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)控制，從而達(dá)到有針對(duì)性的醫(yī)療目的，如細(xì)胞治療或組織/器官再生[14]。聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）是一種溫度響應(yīng)性聚合物，轉(zhuǎn)變溫度為32℃[15]，其相轉(zhuǎn)變行為表現(xiàn)在當(dāng)其水溶液升至一定溫度時(shí)，PNIPAAm 與水發(fā)生相分離，呈現(xiàn)低溫溶解、高溫分相的現(xiàn)象[16]。PNIPAAm 通過(guò)改變溫度控制細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)微環(huán)境，細(xì)胞在不同的環(huán)境中具有不同的黏附程度，能夠進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移[17]。PNIPAAm 的溫度調(diào)節(jié)區(qū)間便于控制且在人體生理溫度范圍內(nèi)，因此，PNIPAAm 水凝膠通常作為促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的平臺(tái)，又可作為組織工程的原位支架，PNIPAAm 水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程領(lǐng)域顯露出巨大的潛力[18-19]。

本文針對(duì)ASF 的缺陷，解決ASF 與高分子材料相容性差的問(wèn)題，并結(jié)合PNIPAAm 水凝膠和ASF在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)，開發(fā)一種具有生物親和性的復(fù)合水凝膠。首先，以ASF 為原料，采用AGE 對(duì)ASF 進(jìn)行改性，在均相條件下合成出具有反應(yīng)性雙鍵的烯丙基絲素蛋白（ASF-AGE），使ASF 大分子肽鏈上增加便于反應(yīng)的活性位點(diǎn)。然后，在不使用任何交聯(lián)劑的情況下，將ASF-AGE 與NIPAAm 進(jìn)行聚合，利用ASF 的自組裝特性，最終形成具有良好溶失穩(wěn)定性和良好綜合力學(xué)性能的p(ASF-AGENIPAAm)溫敏水凝膠。本文研究了ASF-AGE 的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，并探討ASF-AGE 用量對(duì)水凝膠溫敏性、水溶失性和力學(xué)性能的影響。本文制備的水凝膠較PNIPAAm 和ASF 獨(dú)立凝膠比較具有較好的力學(xué)性能和水溶失穩(wěn)定性，有望在細(xì)胞培養(yǎng)、組織支架等領(lǐng)域得到應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

柞蠶繭，購(gòu)置于遼寧柞蠶絲綢科學(xué)研究院有限公司；水合茚三酮，AR純度99%，上海阿拉丁試劑有限公司；烯丙基縮水甘油醚，AR純度99%，上海阿拉丁試劑有限公司；N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm），AR純度98%（在正己烷中重結(jié)晶純化處理），上海阿拉丁試劑有限公司；過(guò)硫酸銨（APS），分析純，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMEDA），分析純，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為市售分析純；高純氮?dú)猓?9.999%，丹東天茂氣體有限公司。

1.2 分析測(cè)試儀器

北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司FD-1C-50 型冷凍干燥機(jī)；美國(guó)Mettler Toledo 公司FE28 型臺(tái)式pH計(jì)；日本島津UV-2600 紫外分光光度計(jì)；德國(guó)Bruker 公司AV 400 型核磁共振波普儀；日本Rigaku公司D/max-2550 型X 射線衍射儀；美國(guó)TA instruments 公司Q-2000 差示掃描量熱儀；美國(guó)FTC公司TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀。

1.3 烯丙基絲素蛋白（ASF-AGE）的制備

（1）柞蠶繭脫膠：將已經(jīng)去除蠶蛹的柞蠶繭剪成2 cm×2 cm 碎片，浸泡于0.5%（質(zhì)量）Na2CO3和0.25%（質(zhì)量）十二烷基硫酸鈉溶液中，蠶繭片與純水浴比為1∶100，沸煮50 min 脫除柞蠶繭表面的絲膠蛋白，用去離子水充分洗滌，重復(fù)三次，將充分脫膠后的柞蠶絲纖維用吹風(fēng)機(jī)吹干后備用。

（2）再生ASF 制備：稱取200 g Ca(NO3)2置于500 ml 錐形瓶中，在105℃±1℃油浴中熔融；量取100 ml熔融Ca(NO3)2置于250 ml 錐形瓶中，加入10 g±0.3 g的柞蠶絲纖維，與熔融Ca(NO3)2組成浴比1∶10 溶液，不斷攪拌溶解3～4 h；待柞蠶絲纖維全部溶解后，通過(guò)雙層脫脂紗布對(duì)粗溶液進(jìn)行過(guò)濾，隨后轉(zhuǎn)入透析袋中，在去離子水環(huán)境下透析除去鹽離子，在4℃恒溫冰箱中透析3 d，每隔6 h 換水一次，并測(cè)試透析液電導(dǎo)率，當(dāng)透析液電導(dǎo)率小于15 μS/cm 并不再變化后即為透析完成。透析后的ASF 溶液在冷凍離心機(jī)中離心（8000 r/min，10 min，4℃），將離心后的上清液在超低溫冰箱中-50℃急速冷凍8 h，然后置于冷凍干燥機(jī)中凍干20h，最后獲得再生ASF。

（3）ASF-AGE 的制備：在250 ml 三口瓶中加入一定量ASF，加入一定量去離子水溶解，ASF 濃度為10 mg/L，采用2 mol/L 的Na2CO3和1 mol/L 的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)pH，通入氮?dú)?，勻速攪拌下滴加AGE，15～30 min 內(nèi)滴加完畢，在一定溫度下反應(yīng)24 h；反應(yīng)結(jié)束后用1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH 至中性。反應(yīng)液裝入透析袋中，4℃下透析2 d，每隔6 h 換水一次。透析后的溶液在超低溫冰箱中-50℃急速冷凍8 h，然后冷凍干燥20 h，得到ASF-AGE。

1.4 溫敏p（ASF-AGE-NIPAAm）水凝膠的制備

將NIPAAm 溶解在去離子水中，配制成75 mg/ml 的溶液，靜置備用。在冰水浴中，將ASF-AGE、APS 和TEMEDA 按表1 比例溶解于去離子水中，通入N2磁力攪拌30 min，在攪拌過(guò)程中逐滴加入一定量的NIPAAm 水溶液，20℃反應(yīng)一段時(shí)間后，待溶液變黏，吸取混合溶液裝入帶蓋玻璃瓶中，在室溫下繼續(xù)自由基聚合反應(yīng)，12 h后得到白色水凝膠，最后將水凝膠裝入透析袋中，去離子水透析3 d 去除未反應(yīng)物質(zhì)，冷凍干燥得到干凝膠。

驅(qū)動(dòng)“創(chuàng)新輪翼”，探索敢為、先為、善為的監(jiān)管新機(jī)制。作為國(guó)務(wù)院批準(zhǔn)的全國(guó)食品安全放心城市試點(diǎn)市，在全省率先提出食品、藥品“雙創(chuàng)建、雙放心”的目標(biāo)，與全國(guó)文明城、全國(guó)衛(wèi)生城“三城同創(chuàng)”，成為盤錦“十三五”期間提升城市實(shí)力、活力、競(jìng)爭(zhēng)力的戰(zhàn)略之一。建立“行刑銜接”機(jī)制，與市級(jí)以上新聞媒體建立廣角型聯(lián)合執(zhí)法機(jī)制，成為中央、省級(jí)主流媒體的基層采風(fēng)哨。自主研發(fā)應(yīng)用的“食藥通”集辦公監(jiān)管等綜合科技信息平臺(tái)為一身。

1.5 氨基轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

采用茚三酮比色法測(cè)定ASF-AGE 氨基轉(zhuǎn)化率。根據(jù)文獻(xiàn)原理[20-21]，以丙氨酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其不同濃度在570 nm 的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。在ASF 與AGE 反應(yīng)前取一定體積的ASF 溶液測(cè)定其570 nm 的吸光度，根據(jù)丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和式（1）確定反應(yīng)前ASF 的氨基含量；同時(shí)，按照該方法，測(cè)定ASF 與AGE 反應(yīng)后的氨基含量。根據(jù)反應(yīng)前后的氨基含量變化，按式（2）計(jì)算氨基轉(zhuǎn)化率。

表1 p（ASF-AGE-NIPAAm）凝膠制備反應(yīng)條件Table 1 Reaction conditions of preparation for p（ASF-AGE-NIPAAm）gel

圖1 丙氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of alanine solution

氨基含量：

氨基轉(zhuǎn)化率：

式中，A 為反應(yīng)液測(cè)得的吸光度值OD570nm；m 為反應(yīng)時(shí)投入柞蠶絲素質(zhì)量，g；V1為測(cè)定時(shí)反應(yīng)液取樣體積ml；V2為測(cè)定時(shí)反應(yīng)液定容體積，ml；10-6為單位換算系數(shù)；X1為反應(yīng)前柞蠶絲素氨基含量，g/ml；X2為反應(yīng)后柞蠶絲素氨基含量，g/ml。

1.6 核磁共振氫譜（1H NMR）測(cè)試

采用核磁共振波譜儀對(duì)ASF-AGE 樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。分別稱取5～8 mg 的干燥樣品裝入干凈的試劑瓶中，用D2O 作為溶劑，樣品溶解后，用微量進(jìn)樣器注入核磁管中，進(jìn)行核磁1H測(cè)試。

1.7 水凝膠溫敏性和LCST測(cè)試

將充分干燥的p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠試樣精確稱量計(jì)為Wd，浸泡在去離子水中，水浴15℃每隔一段時(shí)間用濾紙吸干凝膠表面水分，迅速稱量溶脹水凝膠的質(zhì)量，直至水凝膠樣品達(dá)到吸水飽和計(jì)為Ws，平衡溶脹率（ESR）按式（3）計(jì)算。然后，升高水浴溫度，在不同溫度下計(jì)算其ESR，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制曲線。

采用差式掃描量熱儀測(cè)定p(ASF-AGENIPAAm)水凝膠的低臨界溶解溫度（LCST）。測(cè)試條件：N2氣氛，氣體流量20 ml/min，樣品質(zhì)量約10 mg，溫度范圍0～50℃，升溫速率2℃/min。

1.8 凝膠水溶失性測(cè)試

1.9 凝膠力學(xué)性能測(cè)試

采用質(zhì)構(gòu)儀在壓縮模式下測(cè)試p(ASF-AGENIPAAm)水凝膠樣品的壓縮強(qiáng)度。將水凝膠裁剪成直徑為(10±0.5)mm、高為(8±0.5)mm 圓柱小塊，壓縮速率為5 mm/min，觸發(fā)力為0.5 N，形變?cè)O(shè)置為50%，溫度25℃，相對(duì)濕度65%±5%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 烯丙基絲素蛋白（ASF-AGE）的制備機(jī)理

ASF 和AGE 的反應(yīng)機(jī)理如圖2 所示。ASF 溶解后，ASF大分子肽鏈在溶液中呈無(wú)規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)，能夠?qū)被嘶懵冻鰜?lái)，當(dāng)AGE 逐漸加入后，AGE 的環(huán)氧基團(tuán)在堿性條件下發(fā)生開環(huán)[22]，形成羥基的同時(shí)與柞蠶絲素蛋白的氨基發(fā)生親核取代反應(yīng)，從而形成ASF-AGE。實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化反應(yīng)條件，確定ASF與AGE 的質(zhì)量比為1∶8，水浴20℃，pH=10.5，反應(yīng)24 h。在此條件下，最終得到的ASF-AGE 氨基轉(zhuǎn)化率為55.21%。

2.2 ASF-AGE的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

ASF 和ASF-AGE 的核磁氫譜如圖3 所示。對(duì)比圖3（a）、（b）發(fā)現(xiàn)，ASF-AGE 樣品的化學(xué)位移在δ=5.20 和δ=5.85 處出現(xiàn)新的特征峰，對(duì)應(yīng)于乙烯基上質(zhì)子H-1(2H)和H-2(1H)的特征峰，并且H-1與H-2特征峰的積分比為2∶1。化學(xué)位移在δ=4.55處為環(huán)氧基開環(huán)后H-5(1H)的特征峰；化學(xué)位移在δ=3.49屬于質(zhì)子H-3、H-4、H-6 的特征峰。根據(jù)1H NMR 譜圖結(jié)果，可以判斷AGE 環(huán)氧基團(tuán)開環(huán)與ASF 的氨基發(fā)生反應(yīng)，形成具有雙鍵反應(yīng)性的ASF-AGE。

2.3 p（ASF-AGE-NIPAAm）水凝膠形成過(guò)程

ASF 在水溶液中以無(wú)規(guī)線團(tuán)和α-螺旋結(jié)構(gòu)存在，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)ASF 自組裝形成穩(wěn)定的物理交聯(lián)結(jié)構(gòu)，無(wú)規(guī)線團(tuán)和α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[23]，形成ASF 凝膠；但是，由于ASF 肽鏈上含大量的疏水性聚丙氨酸(-Ala-)n重復(fù)序列，這使得ASF凝膠表現(xiàn)出更強(qiáng)的疏水性，并且ASF凝膠β-折疊為高度結(jié)晶結(jié)構(gòu)，因此ASF 凝膠力學(xué)性能差，且受力后易碎,不能保持凝膠形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整[24]。

圖2 烯丙基絲素蛋白（ASF-AGE）制備機(jī)理Fig.2 Preparation mechanism of ASF-AGE

圖3 ASF（a）和ASF-AGE（b）的1H NMR譜圖Fig.3 1H NMR gspectra of ASF(a)and ASF-AGE(b)

ASF-AGE 溶液的凝膠化過(guò)程以及線性PNIPAAm 的溫敏行為如圖4 所示。由圖4(a)可以看到，新鮮的ASF-AGE 溶液呈透明狀，放置一段時(shí)間后自組裝形成白色凝膠，但是，樣品瓶中的ASFAGE 凝膠受到輕微晃動(dòng)和倒置后，凝膠破碎且低濃度的ASF-AGE依然可以流動(dòng)。雖然ASF-AGE溶液的凝膠化轉(zhuǎn)變迅速，但其本身并不能保持穩(wěn)定的凝膠形態(tài)，這表明ASF-AGE與ASF二者具有相似的凝膠化現(xiàn)象。由圖4(b)可以看到，線性PNIPAAm 室溫(20℃)下呈無(wú)色透明狀，并且可以流動(dòng)，當(dāng)溫度高于低臨界溶解溫度(LCST)時(shí)，無(wú)色透明溶液變?yōu)榘咨?，但倒置后溶液依然可以流?dòng)，這說(shuō)明在無(wú)交聯(lián)劑的情況下，線性PNIPAAm不能夠形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的水凝膠。通過(guò)對(duì)ASF-AGE溶液和線性PNIPAAm 溶液的分析，表明ASF-AGE 和線性PNIPAAm 均不能獨(dú)立形成完整形態(tài)的凝膠，不能獨(dú)立作為細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)使用。

ASF-AGE 與NIPAAm 聚合形成p(ASF-AGENIPAAm)水凝膠過(guò)程如圖5 所示。在引發(fā)劑的作用下，NIPAAm 發(fā)生自由基聚合，并與ASF-AGE 中的烯丙基雙鍵通過(guò)共價(jià)鍵發(fā)生聚合；在NIPAAm 與ASF-AGE 聚合的同時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體系黏度逐漸增大，ASF-AGE 大分子肽鏈與PNIPAAm大分子鏈纏結(jié)到一起，通過(guò)ASF-AGE 的凝膠化自組裝，最終形成具有較好形態(tài)的水凝膠材料。

2.4 p（ASF-AGE-NIPAAm）水凝膠結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析

圖4 ASF-AGE的凝膠化現(xiàn)象(a);線性PNIPAAm溫敏特性(b)Fig.4 Gelation behavior of ASF-AGE solution(a);thermosensitive behavior of linear PNIPAAm(b)

圖5 p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠形成過(guò)程Fig.5 Preparation process of p(ASF-AGE-NIPAAm)hydrogel

圖6 顯示的是樣品的XRD 譜圖，其中圖6（a）是凍干后ASF 和ASF-AGE 的XRD 譜圖，圖6（b）是不同ASF-AGE 含量下p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠的XRD 譜圖。由圖6（a）可以看到，ASF 和ASFAGE 的2θ 在11.5°和22.3°處具有明顯的衍射峰，對(duì)應(yīng)的是絲素蛋白silkⅠ結(jié)構(gòu)，對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)和α-螺旋結(jié)構(gòu)，這說(shuō)明ASF-AGE 的二級(jí)結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化。圖6（b）中p(ASF-AGENIPAAm)水凝膠主要在8.2°和20.3°具有較寬的衍射峰，在16.7°和24.5°處具有微弱的衍射峰，表現(xiàn)出絲素蛋白典型的silkⅡ結(jié)構(gòu)，對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)為β-折疊結(jié)構(gòu)，與ASF 的結(jié)晶結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)。在反應(yīng)過(guò)程中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ASF-AGE 發(fā)生凝膠化自組裝，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)線團(tuán)和α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，這與柞蠶絲纖維的結(jié)晶結(jié)構(gòu)相同，這樣穩(wěn)定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)可能使p(ASF-AGENIPAAm)水凝膠展現(xiàn)出良好的機(jī)力學(xué)性能。

圖6 ASF和ASF-AGE(a)以及不同ASF-AGE含量p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠（b）的XRD譜圖Fig.6 XRD patterns of ASF and ASF-AGE(a),and p(ASF-AGE-NIPAAm)hydrogels with different ASF-AGE content(b)

2.5 p（ASF-AGE-NIPAAm）水凝膠溫敏特性

p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠的DSC 曲線如圖7 所示。DSC 曲線上吸熱峰起始溫度與最大吸熱溫度的切線為樣品的低臨界溶解溫度（LCST）。顯然，所有樣本在32℃附近都顯示出相似的LCST，這與PNIPAAm 水凝膠的LCST相對(duì)應(yīng)[25]。隨著ASF-AGE含量的增加，水凝膠的LCST 略有下降，這是因?yàn)镻NIPAAm 的溫敏特性是由于疏水基團(tuán)異丙基與親水基團(tuán)酰胺基相互作用產(chǎn)生的，ASF-AGE 本身含有大量的超疏水聚丙氨酸片段，凝膠網(wǎng)絡(luò)中大量的聚丙氨酸使水凝膠的疏水性增強(qiáng)，ASF-AGE 上的烯丙基雙鍵與NIPAAm 發(fā)生共聚后PNIPAAm 主鏈的疏水性增強(qiáng)所導(dǎo)致的。

圖7 不同ASF-AGE含量的p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠DSC曲線Fig.7 DSC curves for p(ASF-AGE-NIPAAm)hydrogels with different ASF-AGE content

圖8 PNIPAAm水凝膠可逆溶脹-收縮過(guò)程Fig.8 Reversible swelling-shrink process of PNIPAAm

PNIPAAm 為典型的高溫收縮型溫敏聚合物，PNIPAAm 類水凝膠在LCST 以下時(shí)，水凝膠表現(xiàn)出清澈、透明以及均勻的狀態(tài)，當(dāng)溫度高于LCST 時(shí)，水凝膠體積急劇收縮，平衡溶脹率（ESR）發(fā)生改變，大分子鏈構(gòu)象的微觀變化，導(dǎo)致凝膠的親/疏水性發(fā)生根本變化，這是一個(gè)可逆溶脹-收縮過(guò)程（圖8）。因此，研究水凝膠的ESR 與溫度之間的關(guān)系，可以直觀反映出水凝膠的溫敏特性，同時(shí)也能間接評(píng)估水凝膠的LCST。

ESR 的溫度依賴性如圖9 所示。ESR 數(shù)據(jù)表明[圖9（a）]，所有水凝膠都具有相似的溫敏特性，ESR數(shù)據(jù)對(duì)溫度的微分曲線[圖9（b）]表明所有水凝膠的ESR 在接近32℃時(shí)均顯著降低，在32℃時(shí)的相分離速率最快。由圖9 可以看到，當(dāng)溫度低于LCST 時(shí)（T＜32℃），凝膠的ESR 在不同ASF-AGE 含量下表現(xiàn)出不同的水平；在室溫環(huán)境下，隨著ASF-AGE 含量的增加，其ESR 呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，這也可以通過(guò)大量的聚丙氨酸引起的疏水性增強(qiáng)來(lái)解釋。通過(guò)ESR觀測(cè)的LCST 數(shù)據(jù)與DSC 曲線數(shù)據(jù)相吻合，可以確定p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠具有PNIPAAm 同樣的溫敏特性和可逆溶脹-收縮過(guò)程。

2.6 p（ASF-AGE-NIPAAm）水凝膠的溶失穩(wěn)定性

圖9 p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠不同溫度下的ESR曲線（a）和ESR對(duì)溫度的微分曲線（b）Fig.9 ESR curves(a)and integral curves(b)for p(ASF-AGE-NIPAAm)hydrogels under different temperature

p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠的水溶失性與凝膠自身的親水基團(tuán)含量和ASF 分子結(jié)構(gòu)的結(jié)晶度相關(guān)，通過(guò)對(duì)該凝膠的水溶失率分析，可以評(píng)價(jià)其作為生物醫(yī)學(xué)材料的體內(nèi)外穩(wěn)定性[26]。p(ASFAGE-NIPAAm)水凝膠的水溶失率如圖10 所示。由圖可知，該水凝膠的水溶失率隨著ASF-AGE 的含量增加而降低，pAGN4 樣品的水溶失率最低，其值為5.61%；當(dāng)ASF-AGE 的含量繼續(xù)增加，pAGN5 樣品的水溶失率升高，這是因?yàn)锳SF-AGE 的轉(zhuǎn)化率有限，ASF-AGE 上并沒(méi)有足夠多的烯丙基與NIPAAm 發(fā)生共聚合，因此水凝膠體系中仍有多余的PNIPAAm 在可逆溶脹-收縮過(guò)程中溶于水中并析出，導(dǎo)致水溶失率增加。

圖10 不同ASF-AGE含量p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠的水溶失率Fig.10 Dissolve-loss ratio of p(ASF-AGE-NIPAAm)hydrogels with different ASF-AGE content

2.7 p（ASF-AGE-NIPAAm）水凝膠力學(xué)性能

水凝膠材料多應(yīng)用在含水的介質(zhì)，在水中可以膨脹到很高的程度，這導(dǎo)致聚合物鏈密度降低，使水凝膠的物理強(qiáng)度極差。在細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程領(lǐng)域，材料所需的力學(xué)性能更加多樣化，細(xì)胞生長(zhǎng)支架的力學(xué)性能應(yīng)與宿主組織所需的力學(xué)性能相匹配，傳統(tǒng)的水凝膠難以實(shí)現(xiàn)[27-29]。

ASF-AGE 和PNIPAAm 均難以獨(dú)立形成水凝膠，ASF-AGE 與NIPPAAm 共聚復(fù)合后形成較為完好形態(tài)的水凝膠。因此，為了研究p(ASF-AGENIPAAm)復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能，采用壓縮實(shí)驗(yàn)對(duì)達(dá)到一半ESR 的復(fù)合水凝膠進(jìn)行表征，研究不同ASF-AGE 含量對(duì)復(fù)合水凝膠力學(xué)性能的影響，如圖11 所示。圖11（a）中，每個(gè)水凝膠樣品在50%的形變內(nèi)并未顯示出破碎的情況，水凝膠的強(qiáng)度隨著ASF-AGE 含量的增加而增大，pAGN4 和pAGN5 承受的最大壓力均超過(guò)100 kPa，分別為101.26 kPa 和117.85 kPa；說(shuō)明水凝膠中ASF-AGE 的結(jié)晶結(jié)構(gòu)使其機(jī)械強(qiáng)度得到增加，保證水凝膠能夠承受一定的壓力。隨著ASF-AGE 含量的增加，水凝膠的彈性模量[圖11（b）]由（80±23）kPa(pAGN1)逐漸提高到（606±93）kPa(pAGN4)，彈性模量增加了約8 倍；說(shuō)明相互纏結(jié)的大分子相互作用提升了水凝膠的彈性范圍。但是，隨著ASF-AGE 含量繼續(xù)增加，pAGN5 的彈性模量下降至（467±61）kPa；這是因?yàn)殡S著ASF-AGE 含量增加，體系中沒(méi)有足夠多的烯丙基與NIPAAm 發(fā)生共聚合，導(dǎo)致多余的ASF-AGE自組裝聚集在一起，形成很強(qiáng)的集中結(jié)晶，這種聚集雖然強(qiáng)度較高，但會(huì)導(dǎo)致水凝膠整體剛性變大。總體而言，pAGN4 具有較好的綜合力學(xué)性能，可以滿足生物組織細(xì)胞體內(nèi)外培養(yǎng)所需的力學(xué)性能要求[30-31]。

3 結(jié) 論

圖11 不同ASF-AGE含量p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線（a）和彈性模量（b）Fig.11 Stress-strain curves(a)and elasticity modulus(b)of p(ASF-AGE-NIPAAm)hydrogels with different ASF-AGE content

（1）利用ASF 氨基與AGE 環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)機(jī)制，堿性條件下使AGE 環(huán)氧基團(tuán)開環(huán)與ASF 的氨基發(fā)生反應(yīng)，制備具有反應(yīng)性雙鍵的ASF-AGE；1H NMR表明，烯丙基雙鍵成功引入ASF大分子鏈上；當(dāng)ASF與AGE 的質(zhì)量比為1∶8，水浴20℃，pH=10.5，反應(yīng)24 h 時(shí)，ASF-AGE 的氨基轉(zhuǎn)化率為55.21%；烯丙基的引入，為ASF 與烯丙基單體共聚提供有利條件，解決ASF與高分子聚合物相容性差的問(wèn)題。

（2）在不含交聯(lián)劑的情況下，通過(guò)ASF-AGE 和NIPAAm 共聚復(fù)合，制備了溫敏p(ASF-AGENIPAAm)水凝膠，該凝膠具有穩(wěn)定的β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，并且具有明顯的溫敏特性，表現(xiàn)出良好的可逆溶脹-收縮過(guò)程，其LCST約32℃。

（3）p(ASF-AGE-NIPAAm)水 凝 膠 隨 著ASFAGE 含量的增加，水溶失性和力學(xué)性能得到明顯提升，在ASF-AGE 與NIPAAm 比例為4/6 時(shí)，p(ASFAGE-NIPAAm)水凝膠水溶失率最低為5.61%，ESR達(dá)到50%形變所承受的最大壓力為101.26 kPa，彈性 模 量 為（606±93）kPa，綜 合 力 學(xué) 性 能 較 好。p(ASF-AGE-NIPAAm)水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)、組織支架等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。