SOCS2、SOCS5在兒童過敏性紫癜中的表達(dá)及其意義

王鳳英，黃路圣，徐康，葉林華，黃云，李釗，徐進(jìn)

（揚(yáng)州大學(xué)附屬泰興醫(yī)院 兒科，江蘇 泰興 225400）

過敏性紫癜（henoch-schoenlein purpura，HSP）是一種以小血管為主要病變的全身性血管炎，是兒童最常見的血管炎。至今HSP的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚[1]。研究表明，HSP急性期存在明顯的免疫功能異常，包括體液免疫紊亂、T細(xì)胞亞群功能失調(diào)及細(xì)胞因子異常分泌等。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白2（suppressors of cytokine signaling，SOCS2）和 SOCS5是SOCS家族家族中重要的分子，研究發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)免疫功能，影響免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展。本研究旨在研究SOCS2、SOCS5在兒童HSP中的表達(dá)及其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年9月-2015年6月?lián)P州大學(xué)附屬泰興醫(yī)院住院或門診的HSP新發(fā)患者，對照組為門診健康體檢兒童。HSP患兒36例，診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)免疫學(xué)組制定的兒童HSP循證診治建議[2]。HSP患兒均為初次發(fā)病，病程≤3 d，在受檢前4周內(nèi)未使用任何糖皮質(zhì)激素或細(xì)胞毒性藥物。其中，男性21例，女性15例；年齡（7.8±3.2）歲；單純皮膚型8例，混合型28例（23例伴關(guān)節(jié)癥狀，16例伴消化道癥狀，5例伴腎臟損害）。對照組兒童17例均為無過敏性疾病史的健康兒童。其中，男性10例，女性7例；年齡（7.5±2.5）歲。正常受試者無嚴(yán)重心、肝疾患及惡性腫瘤病史，近期無呼吸道感染病史及免疫抑制劑應(yīng)用史。兩組兒童年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.190和0.010，P=0.871和0.931）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對象家長知情同意。

1.2 材料與試劑

人外周血淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶科技有限公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參基因，SOCS2、SOCS5、GAPDH的引物設(shè)計(jì)和合成由上海生工生物工程有限公司完成，目的基因和內(nèi)參基因的引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自美國Thermo公司。

1.3 儀器與設(shè)備

低速離心機(jī)、TDZ5WS購自長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，低溫高速離心機(jī)、Heraeus Multifuge XIR Thermo Fisher購自上海賽默飛世爾儀器有限公司，分光光度計(jì)、Eppendorf Biophotometer plus購自德國eppendorf公司，PCR儀為伯樂C1000 Thermal Cycle（美國Bio Rad公司），凝膠成像儀、Tanon3 500購自上海天能科技有限公司。

表1 PCR引物序列

1.4 方法

1.4.1 提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）使用肝素鈉抗凝管采集HSP患兒治療前和對照組兒童外周靜脈血2 ml，用密度梯度離心法分離出PBMC，用Trizol懸浮，置于-80℃冰箱保存，待測SOCS2和SOCS5 mRNA含量。

1.4.2 mRNA提取和脫氧核糖核酸cDNA合成嚴(yán)格按照Trizol試劑盒說明書步驟，用PBMC提取總mRNA，然后將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體系為20μl，在0.2ml EP管中進(jìn)行。

1.4.3 SOCS22、SOCS5基因表達(dá)檢測反應(yīng)體系為25μl，其中 SYBR Green Ⅰ 12.5μl，cDNA 0.3μl，正反向引物各0.3μl，加去核酸水至25μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共39個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒SOSC2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較

兩組患兒SOCS2和SOCS5 mRNA的表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HSP組較對照組高。見表2。

2.2 不同臨床類型HSP患兒SOSC2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較

混合型HSP患兒SOCS2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平與單純型HSP患兒比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），混合型HSP患兒SOCS2和SOCS5 mRNA表水平較單純型患兒高。見表3。

2.3 不同性別HSP患兒SOSC2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較

不同性別HSP患兒SOCS2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表2 兩組患兒SOSC2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 兩組患兒SOSC2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

HSP組（n =36） 20.995±7.571 7.253±1.036對照組（n =17） 6.603±1.566 3.992±0.817 t值 2.152 2.47

表3 不同臨床類型HSP患兒SOSC2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

表3 不同臨床類型HSP患兒SOSC2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

混合型（n =28） 26.926± 9.930 10.536 ±4.992單純型（n =8） 4.050±1.176 3.060±2.263 t值 2.288 3.791

表4 不同性別HSP患兒SOSC2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

表4 不同性別HSP患兒SOSC2和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

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3 討論

HSP是兒童的常見病、多發(fā)病，發(fā)病率逐年增加，其發(fā)病原因目前認(rèn)為非單一因素所致，是多種因素綜合作用的結(jié)果。其可能機(jī)制為環(huán)境中的各種刺激因子作用于具有遺傳背景的個(gè)體，引起T、B淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂，激發(fā)B細(xì)胞克隆擴(kuò)增，導(dǎo)致免疫球蛋白A介導(dǎo)的廣泛的白細(xì)胞碎裂性小血管炎；血清中多種炎癥細(xì)胞因子升高；凝血因素也參與其中，小血管局部可有血栓形成。近年來對T淋巴細(xì)胞亞群的研究較多，結(jié)果報(bào)道也不一致，但比較一致的是發(fā)現(xiàn)HSP患者存在Th細(xì)胞免疫功能紊亂，急性期體內(nèi)存在Th1/Th2失衡，主要表現(xiàn)為Th2的優(yōu)勢活化[3-4]。Th細(xì)胞是免疫反應(yīng)重要的調(diào)控/效應(yīng)細(xì)胞，Th細(xì)胞失衡則引起免疫功能紊亂，協(xié)同其他因子導(dǎo)致免疫性疾病發(fā)生。新近發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）和Th17細(xì)胞亦是導(dǎo)致HSP免疫失衡的重要原因[5-6]。

研究證實(shí)，SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS5等均可參與Th細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)。SOCS1在Thl細(xì)胞中高表達(dá)，可抑制Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)Thl細(xì)胞的分化；SOCS3在Th2細(xì)胞中高表達(dá)，可通過抑制Thl細(xì)胞分化，促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化，使Th2型反應(yīng)增強(qiáng)[7-8]。SOCS2可抑制Th2細(xì)胞的分化和發(fā)育，影響Ⅱ型過敏反應(yīng)等免疫反應(yīng)的發(fā)生，對Treg的穩(wěn)定也發(fā)揮重要作用[9-10]；SOCS5主要表達(dá)在Th1細(xì)胞，正向調(diào)控Th1細(xì)胞分化，負(fù)向調(diào)控Th2細(xì)胞分化[11-12]。SOCS各分子間有相互作用，SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS5間存在相互作用。SOCS2能抑制SOCS1或SOCS3的表達(dá)[13]。TANNAHILL等[14]研究認(rèn)為，SOCS2的表達(dá)可顯著減少細(xì)胞因子刺激產(chǎn)生的SOCS3水平，促進(jìn)白細(xì)胞介素2（Interleukin-2，IL-2）和IL-3信號(hào)，影響T淋巴細(xì)胞的增生；Thl細(xì)胞分泌SOCS1造成炎癥發(fā)生的同時(shí)，SOCS5也升高，可能對機(jī)體起保護(hù)作用。SOCS分子是JAK-STAT信號(hào)通路重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)者，通過下調(diào)該信號(hào)通路調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化、活化和功能[15-18]，從而影響多種炎癥因子的表達(dá)與釋放，參與免疫性、炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展[19]。SOCS在免疫過敏性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[19]，研究證實(shí)，SOCS2、SOCS5參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘等疾病的發(fā)病過程，SOCS1、SOCS3也參與多種免疫性疾病的發(fā)病[20-21]。

本研究檢測36例HSP兒童急性期SOCS2、SOCS5基因的表達(dá)，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)HSP組患兒SOCS2和SOCS5 mRNA表達(dá)升高，且混合型HSP較單純型HSP患兒的表達(dá)量升高。結(jié)合前期研究，HSP患兒體內(nèi)SOCS1、SOCS3表達(dá)升高，尤其以SOCS3升高更明顯[22]，筆者分析，在HSP患兒體內(nèi)多種因素的影響下，SOCS3的表達(dá)升高，促使HSP患兒表現(xiàn)為Th2的優(yōu)勢活化，SOCS1、SOCS2、SOCS5的表達(dá)適應(yīng)性增高，但SOCS1、SOCS2、SOCS5的升高不足以抑制SOCS3引起的Th2細(xì)胞分化和活化。OHSHIMA等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘動(dòng)物模型中，SOCS5的過表達(dá)不能抑制TH2反應(yīng)。本研究結(jié)果同樣提示，在HSP中SOCS1、SOCS2、SOCS5等表達(dá)升高未能抑制Th2的優(yōu)勢活化。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，HSP病情越重，SOCS2、SOCS5的升高越明顯，提示SOCS2、SOCS5與HSP患兒的病情有關(guān)。周月宏等[24]研究發(fā)現(xiàn)，SOCS2過表達(dá)可通過抑制腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子IL-6、腫瘤壞死因子α的表達(dá)，而抑制其炎癥反應(yīng)；在HSP患兒中，尚不清楚SOCS2、SOCS5通過何種機(jī)制發(fā)揮抑制Th2型細(xì)胞反應(yīng)。不同的SOCS成員可作為藥物治療的靶分子，藥物通過干預(yù)SOCS蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞因子的分泌，從而治療免疫相關(guān)性疾病[21]。由于發(fā)病機(jī)制和機(jī)體免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)自身調(diào)整功能的復(fù)雜性，上述SOCS分子在HSP患兒中升高的始動(dòng)因素、參與HSP發(fā)病的分子機(jī)制，以及相互作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究，為SOCS治療HSP等免疫性疾病的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

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