二甲雙胍通過(guò)調(diào)節(jié)FGF21/adiponectin軸改善NAFLD大鼠脂代謝紊亂

申 甜，雷 濤，陳 琳，徐碧林，夏 娟，汪紅平

0 引言

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以肝臟內(nèi)三酰甘油(TG)過(guò)度聚集為特征的肝臟疾病，在西方國(guó)家糖尿病患者群中發(fā)病率達(dá)21%～78%[1]，胰島素抵抗(IR)是NAFLD和2型糖尿病(T2DM)發(fā)生及疾病發(fā)展變化的中心環(huán)節(jié)。脂聯(lián)素(Adiponectin)與瘦素、腫瘤壞死因子等脂肪因子不同，具有抗炎、抗糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，參與糖脂代謝及炎癥反應(yīng)等多個(gè)生理過(guò)程，與 NAFLD 密切相關(guān)[2]。近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的成纖維生長(zhǎng)因子21(Fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)可部分依賴PPARγ活性，刺激脂肪細(xì)胞中adiponectin的轉(zhuǎn)錄及分泌。且Lin等[3]證實(shí)，外源性重組FGF21因子需要依賴脂聯(lián)素而發(fā)揮降糖降脂作用。FGF21/adiponectin軸通過(guò)調(diào)節(jié)多器官而維持機(jī)體的糖脂及能量代謝平衡，因此將成為治療NAFLD的新靶點(diǎn)。多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，二甲雙胍可上調(diào)NAFLD患者血清脂聯(lián)素水平而改善IR，本研究采用高脂飲食建立大鼠NAFLD模型[4-5]，探討二甲雙胍是否通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性FGF21/adiponectin軸變化而逆轉(zhuǎn)NAFLD的進(jìn)程。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠40只，4周齡，體重(170±20) g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，由上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心分籠喂養(yǎng)。正常普通飼料(蛋白質(zhì)21%、脂肪6%、碳水化合物55%)，高脂飼料(83%基礎(chǔ)飼料，10%豬油，5%蔗糖，1.5%膽固醇，0.5%膽鹽)由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司定制生產(chǎn)。鹽酸二甲雙胍片(500 mg/片，上海施貴寶制藥公司，批號(hào)：1112103)。胰島素(FINS)、脂聯(lián)素、FFA及三酰甘油試劑盒均購(gòu)自上海鈺森生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScript TM RT 購(gòu)自THERMO公司，熒光定量PCR試劑盒 SYBR premix EX TaqTMⅡ購(gòu)于日本TaKaRa Bio株式會(huì)社。

1.2 方法 ①NAFLD模型制備及分組：為適應(yīng)環(huán)境，40只大鼠予以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(NC組，15只，普通飼料)和高脂飲食組(HF組，25只，高脂飼料)喂養(yǎng)8周，兩組隨機(jī)抽取5只(NC1組、HF1組)，經(jīng)稱重、檢測(cè)血糖血脂等生化學(xué)指標(biāo)及行肝組織病理檢測(cè)，以體重、肝臟濕重明顯增加，血空腹胰島素(FINS)、穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)(HOMA-IR)明顯升高，血脂指標(biāo)(TC、TG)及肝功能指標(biāo)(ALT、AST)明顯升高，肝臟病理組織學(xué)示肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)細(xì)胞腫脹，胞核消失或被脂肪空泡，證實(shí)HF組NAFLD造模成功。剩余20只HF大鼠再隨機(jī)分為2組：模型組(HF組，等體積生理鹽水)、二甲雙胍干預(yù)組[HF+M組，加二甲雙胍500 mg/(kg·d)]，每組10只，連續(xù)灌胃8周。藥物干預(yù)期間，對(duì)照組大鼠繼續(xù)給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，模型組及二甲雙胍組大鼠繼續(xù)予以高脂飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠禁食不禁水12 h，行乙醚腹腔麻醉大鼠，稱重，腹主動(dòng)脈采血，分離血清并轉(zhuǎn)移至新的EP管，放置-80 ℃低溫冰箱保存；同時(shí)迅速分離取出肝臟組織并稱重，甲醛溶液固定，制備石蠟切片，行HE染色觀察肝臟病理組織學(xué)變化；其余肝臟及部分附睪脂肪組織放置于-80 ℃凍存?zhèn)錅y(cè)Real-time PCR。

②血清指標(biāo)生化檢測(cè)：采用日本OLYMPUS公司AU2700型全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽固醇(TC)、TG、空腹血糖(FBG)、血清空腹胰島素(FINS)、肝臟TG含量、FGF21、脂聯(lián)素，均按照ELISA 試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)IRI=(FINS×FBG)/22.5。

③肝臟病理組織學(xué)觀察：取相同部位肝右葉，大小約2 cm×2 cm×0.3 cm；迅速取出肝臟并稱重，甲醛溶液固定，制備石蠟切片，行HE染色觀察肝細(xì)胞脂肪變性程度、炎性活動(dòng)度及肝纖維化的程度，進(jìn)行肝組織病理學(xué)觀察。

④氯仿∶甲醇(2∶1)肝臟勻漿液的制備及TG含量測(cè)定：稱取適量肝臟組織，放入玻璃勻漿管中，加入3倍體積的甲醇，1 500 r/min電動(dòng)勻漿5 min，倒入離心管中，再加入6倍體積的氯仿，漩渦混合器混勻，制備10%的組織勻漿，根據(jù)TG測(cè)定試劑盒對(duì)TG含量進(jìn)行測(cè)定。

⑤RT-PCR法檢測(cè)肝臟脂聯(lián)素adiponectin、FGF21、AMPK mRNA表達(dá)。脂肪組織adiponectin mRNA表達(dá)：取凍存脂肪及肝臟組織，采用TRIzol抽提大鼠肝臟總RNA，按Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。各基因引物序列：adiponectin:5′-GTCTCCGTGCTTCCGATGAA-3′，5′-GGTCAAACTGGACTTGGGGT-3′；FGF21:5′-GTGCGAGGCATACCCCATC-3′，5′-CCGTCCTCCCTGATCTCCA-3′；AMPK:5′-GAGCCCTGAACTTGCTTTTACA-3′，5′-TGTCCGTTCTATGCGCTGG-3′；GAPDH：5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后，應(yīng)用反應(yīng)產(chǎn)物的溶解曲線檢測(cè)其均一性，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，ABI7300 SDS Software自動(dòng)分析熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換Ct值。以GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行規(guī)一化處理，ΔCt為目的基因Ct值與內(nèi)參Ct值的差值，最終以2-ΔΔCt作為目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD模型建立 喂養(yǎng)8周，NC1組、HF1組大鼠生化學(xué)指標(biāo)比較，見(jiàn)表1。

2.2 喂養(yǎng)8周末肝臟組織學(xué)比較 肉眼觀察：NC組喂養(yǎng)8周肝臟形態(tài)正常，HF組肝臟外形稍飽滿圓鈍，色紅，質(zhì)地較脆；光鏡觀察：NC組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉肝細(xì)胞分界清晰，胞核圓，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)豐富，未見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性或壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；HF組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索放射狀排列不明顯，大部分細(xì)胞腫脹，胞核消失或被脂肪空泡。見(jiàn)圖1。

圖1 肝臟組織學(xué)比較(HE，200×)

2.3 二甲雙胍干預(yù)8周后各組生化指標(biāo)、FFA測(cè)定及胰島素抵抗指數(shù)比較 見(jiàn)表2。

2.4 肝組織病理HE染色 NC1組肝細(xì)胞形態(tài)、小葉結(jié)構(gòu)及匯管區(qū)均未見(jiàn)異常，幾乎未見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性。HF1組大鼠肝小葉脂質(zhì)沉積明顯，肝細(xì)胞脂質(zhì)變性大部分為小脂滴，伴有氣球樣變，肝竇間隙變窄，HF+M組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)仍有紊亂，細(xì)胞脂滴變小，氣球樣變減少，無(wú)明顯壞死，肝竇間隙無(wú)明顯變窄。見(jiàn)圖2。

2.5 各組肝臟adiponectin、FGF21、AMPK mRNA表達(dá)及脂肪組織adiponectin mRNA表達(dá) 與對(duì)照組比較，模型組肝臟AMPK、adiponectin mRNA表達(dá)均下降；二甲雙胍干預(yù)后，肝臟FGF21、AMPK mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)，而adiponectin mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化；與模型組比較，二甲雙胍可明顯干預(yù)脂肪組織adiponectin mRNA表達(dá)。見(jiàn)圖3、圖4。

表1 NC1組、HF1組大鼠生化學(xué)指標(biāo)比較

注：與NC組比較，*P<0.05

表2 三組大鼠生化學(xué)及胰島素抵抗指標(biāo)比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與HF組比較，#P<0.05

圖2 肝組織病理HE染色結(jié)果(HE，100×)

圖3 肝組織adiponectin、FGF21、AMPK mRNA表達(dá)

圖4 脂肪組織adiponectin mRNA表達(dá)

3 討論

大量研究表明，NAFLD與T2DM、肥胖等代謝綜合征密切關(guān)聯(lián)，并可預(yù)測(cè)T2DM和心血管疾病事件(CVD)的發(fā)生[6-8]。目前有關(guān)NAFLD發(fā)病機(jī)制公認(rèn)的是“二次打擊”學(xué)說(shuō)[9]，即胰島素抵抗造成的脂質(zhì)代謝紊亂對(duì)肝臟造成第一次打擊，而氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活對(duì)肝臟造成第二次打擊。

脂肪組織除作為體內(nèi)最大的能量提供者之外，還是人體內(nèi)重要的內(nèi)分泌器官，可分泌多種細(xì)胞因子，包括游離脂肪酸(FFA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)、IL-6、脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素等，而營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩會(huì)造成這些促炎及抗炎因子的失平衡而加重胰島素抵抗介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)量聚集。脂聯(lián)素是1995年Sherer等[10]首次報(bào)道的一種由脂肪組織分泌的血漿激素蛋白，與肥胖、糖尿病、胰島素抵抗有關(guān)，是體內(nèi)唯一與體脂含量呈負(fù)相關(guān)的脂肪因子。脂聯(lián)素轉(zhuǎn)基因小鼠的血漿TG和FFA較對(duì)照組均下降，肝臟脂肪沉積減輕[11]。FGF21是最先由 Nishimura等[12]于2000年從小鼠胚胎組織中分離出的FGF 基因家族中的一位新成員，主要由肝臟分泌入血，對(duì)維持脂代謝的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。研究顯示，血清 FGF21 表達(dá)水平與NAFLD肝臟脂肪變性嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[13]。2005年Kharitonenkov等[14]首次報(bào)道FGF-21具有調(diào)節(jié)血糖、改善胰島素敏感性及抑制肝糖輸出的作用，且與循環(huán)脂聯(lián)素水平增加以及體脂含量減少有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組大鼠體重及血清TC、TG、ALT、AST、FBG、FINS，以及肝臟TG含量、HOMA-IR高于正常對(duì)照組，但血清adiponectin水平下降，F(xiàn)GF21水平升高；二甲雙胍干預(yù)后，HF組大鼠血清TC、TG、FFA、FBG、ALT、AST降低，肝臟TG含量及HOMA-IR降低，血清adiponectin、FGF21水平升高。鑒于adiponectin、FGF21對(duì)調(diào)節(jié)糖脂代謝及能量平衡的正性作用，推斷二者可能參與二甲雙胍對(duì)糖脂代謝及胰島素抵抗的調(diào)控作用。此外，肝臟病理學(xué)提示，二甲雙胍可以有效減輕肝臟脂質(zhì)沉積，逆轉(zhuǎn)NAFLD的脂肪變性。

二甲雙胍是經(jīng)典的降糖藥物，可以改善肝臟胰島素抵抗，并改善外周器官對(duì)胰島素的敏感性，促進(jìn)脂肪酸的氧化，同時(shí)還達(dá)到抑制脂肪生成的目的。在NAFLD的診療指南[15]中，也推薦二甲雙胍用于人類NAFLD的治療。2005年的一項(xiàng)隨機(jī)開(kāi)放研究中，與維生素E或飲食控制比較，二甲雙胍可更好地改善NAFLD患者的轉(zhuǎn)氨酶水平和肝臟組織病變[16]。Shargorodsky等[17]發(fā)現(xiàn)，使用二甲雙胍可通過(guò)調(diào)節(jié)脂聯(lián)素和TNF-α基因表達(dá)而改善脂肪代謝，部分逆轉(zhuǎn)NAFLD患者肝細(xì)胞脂肪變性和炎性反應(yīng)。

本研究PCR結(jié)果提示，模型組大鼠肝臟組織AMPK、adiponectin mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降，而FGF21 mRNA 略有增加的趨勢(shì)；說(shuō)明在糖脂代謝紊亂的內(nèi)環(huán)境下可刺激肝臟分泌FGF21，而AMPK和adiponectin mRNA表達(dá)受抑制。二甲雙胍干預(yù)8周后，肝臟AMPK、FGF21 mRNA表達(dá)較模型組明顯增加，與Nygaard等[18]報(bào)道一致，adiponectin mRNA無(wú)明顯變化；然而，脂肪組織adiponectin mRNA較模型組明顯升高。

脂聯(lián)素主要由脂肪細(xì)胞特異性分泌，在肥胖和代謝綜合征人群中明顯下降；而FGF21水平在代謝疾病(如：IR、T2DM、NAFLD、冠心病、PCOS)中明顯升高。二者之所以呈現(xiàn)相反的變化，其主要原因如下：①FGF21與其他炎性細(xì)胞因子及激素(如兒茶酚胺、胰島素、糖皮質(zhì)激素、TNF-α、IL-6)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，氧化應(yīng)激等共同參與調(diào)節(jié)adiponectin的分泌；②肥胖狀態(tài)下，脂肪組織存在FGF21抵抗。用外界注入重組FGF21或ADPN，可以改善肥胖相關(guān)的氧化應(yīng)激和胰島素抵抗，對(duì)體重和高血糖有益?？傊呤菍?duì)調(diào)節(jié)糖脂代謝及胰島素抵抗具有多效作用的代謝因子。

本研究表明，使用二甲雙胍可以刺激肝臟AMPK及FGF21 mRNA表達(dá)明顯增加，且血FGF21濃度增加，通過(guò)結(jié)合脂肪組織FGF21復(fù)核受體刺激脂肪組織adiponectin的分泌及表達(dá)，發(fā)揮增加胰島素敏感性及減輕脂質(zhì)沉積的作用。同樣，國(guó)外動(dòng)物有實(shí)驗(yàn)提示，F(xiàn)GF21-adiponectin 軸通過(guò)調(diào)節(jié)多器官對(duì)話而保護(hù)糖脂代謝平衡。綜上所述，二甲雙胍作為AMPK激活劑，可以顯著增加肝臟FGF21表達(dá)及分泌，進(jìn)而刺激脂肪組織分泌劑表達(dá)adiponectin水平，最終通過(guò)調(diào)節(jié)FGF21-adiponectin 軸而發(fā)揮降糖、逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性及改善胰島素敏感性的作用，為二甲雙胍治療NAFLD提供有力的證據(jù)。有關(guān)FGF21如何刺激脂肪adiponectin的過(guò)表達(dá)，以及與二甲雙胍的濃度及血脂、血糖的濃度之間是否存在量效反應(yīng)，今后仍需要進(jìn)一步的研究。

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