缺氧下神經(jīng)生長因子受體p75在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)的變化及生物學(xué)特點(diǎn)

樊長暉，許長寶，趙興華，郝 斌，吳國清

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450014

神經(jīng)生長因子受體p75(nerve growth factor receptor p75，p75 NGFR)是神經(jīng)生長因子跨膜糖蛋白受體，它在眾多腫瘤組織中的表達(dá)及其功能都有報(bào)道。在不同腫瘤組織中執(zhí)行的功能不同，在乳腺癌中具有促進(jìn)腫瘤生長和抗凋亡作用，而在胃癌及膀胱癌中有抑癌基因作用。缺氧是實(shí)體瘤的重要特點(diǎn)，是導(dǎo)致腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的重要微環(huán)境。為進(jìn)一步了解缺氧環(huán)境下膀胱癌細(xì)胞的表面蛋白及基因表達(dá)變化以及膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，本課題研究了缺氧條件下p75 NGFR在不同分化的膀胱癌細(xì)胞系上的表達(dá)變化，缺氧條件下膀胱癌細(xì)胞的凋亡以及對化療藥物的敏感性等生物學(xué)特性，為臨床尋找控制膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移以及抗藥性新靶點(diǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料膀胱鱗癌細(xì)胞株SCaBER和中分化的移行細(xì)胞癌細(xì)胞株5637購于中科院上海細(xì)胞所。鼠抗人p75 NGFR單克隆抗體購自Biosource公司，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉公司。兩步法RT-PCR試劑盒購于上海生工生物工程有限公司。

1.2缺氧條件下的細(xì)胞培養(yǎng)將不同膀胱癌組織來源的鱗癌細(xì)胞株SCaBER和中分化的移行細(xì)胞癌細(xì)胞株5637分別置于正常氧濃度條件下(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、體積分?jǐn)?shù)21% O2和體積分?jǐn)?shù)74% N2)和缺氧(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、體積分?jǐn)?shù)10% O2和體積分?jǐn)?shù)85% N2)環(huán)境中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分別收集了SCaBER和5637在正常氧濃度條件下和缺氧條件下24、48和72 h的細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.3 2種細(xì)胞中p75NGFR蛋白的表達(dá)取對數(shù)生長期的膀胱癌細(xì)胞，用0.2 g/L EDTA消化后，1 500 r/min離心5 min，棄上清。用PBS重懸細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清。制成單細(xì)胞懸液，移至EP管中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1。取細(xì)胞懸液100 μL，加鼠抗人p75NGFR單克隆抗體5 μL，4 ℃避光孵育30 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次。各加入兔抗鼠熒光標(biāo)記的抗體IgG 5 μL，置室溫1 h，用PBS洗滌細(xì)胞3次。另取細(xì)胞懸液100 μL，直接加入兔抗鼠熒光標(biāo)記的抗體IgG 5 μL，置室溫1 h，用PBS洗滌細(xì)胞3次，作為對照。流式細(xì)胞儀檢測p75 NGFR蛋白的熒光標(biāo)記率。每種細(xì)胞均設(shè)6個(gè)平行對照。

1.4 2種細(xì)胞中p75NGFRmRNA表達(dá)的RT-PCR檢測收集SCaBER和5637在正常氧濃度條件下和缺氧條件下培養(yǎng)24、48、72 h的腫瘤細(xì)胞，分別提細(xì)胞的總RNA。各取等量RNA，進(jìn)行RT-PCR。用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到總cDNA，然后以之為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中無菌雙蒸水25.8 μL，10×Buffer 5 μL， MgCl23 μL，dNTP 5 μL，p75 NGFR上、下游引物各2.0 μL，β-actin上、下游引物各1.0 μL，逆轉(zhuǎn)錄混合液5.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物采用凝膠圖像掃描儀拍照并進(jìn)行條帶灰度分析，以p75NGFR/β-actin灰度值的比值代表其相對含量。

1.5不同培養(yǎng)條件下2種細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測膀胱癌細(xì)胞暴露于缺氧環(huán)境 1、3、5、7 d，以常氧培養(yǎng)組作為對照組。收集不同條件下培養(yǎng)的膀胱癌細(xì)胞后4 ℃預(yù)冷，PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度約(0.5～1)×106mL-1，取100 μL細(xì)胞懸液，1 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清，200 μL冰預(yù)冷1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，將試管置于冰上，加5 mL Annexin V-FITC和10 μL PI到100 μL的細(xì)胞懸液中，輕輕混勻；用對照細(xì)胞另設(shè)未染色管、單染Annexin V-FITC管及單染PI管；將樣品輕輕渦旋，將試管置于冰上，室溫避光孵育10 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻，在30 min內(nèi)用波長為488 nm的單發(fā)射激光檢測FITC，分析結(jié)果。以未染色細(xì)胞調(diào)零機(jī)器，以Annexin V-FITC單染管和PI單染管為基準(zhǔn)參照，測定每個(gè)上樣管數(shù)據(jù)，利用Cell Quest 3.0軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和資料分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6不同培養(yǎng)條件下絲裂霉素(MMC)對2種細(xì)胞抑制率影響的MTT法檢測取不同培養(yǎng)條件下的膀胱癌細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為5×104mL-1接種于96孔板，每孔150 μL細(xì)胞懸液，過夜貼壁，加入臨床用藥密度MMC。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，每組細(xì)胞加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸棄培養(yǎng)上清液，加入200 μL DMSO，室溫下振蕩10 min使紫色結(jié)晶全部溶解，在96孔酶標(biāo)儀上以空白對照孔調(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測儀上于492 nm波長檢測各孔吸光度值。各實(shí)驗(yàn)孔吸光度值減去空白對照孔吸光度值得出其A值，間接反映存活細(xì)胞數(shù)量。按下面公式計(jì)算不同條件下的膀胱癌細(xì)胞的活力。細(xì)胞生長抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0進(jìn)行分析。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比不同培養(yǎng)條件下2種膀胱癌細(xì)胞中p75 NGFR蛋白和mRNA表達(dá)的差異，應(yīng)用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同培養(yǎng)條件下2種膀胱腫瘤細(xì)胞中凋亡率的變化和不同培養(yǎng)條件下MMC對2種膀胱癌細(xì)胞抑制率的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同培養(yǎng)條件下2種膀胱癌細(xì)胞中p75NGFR蛋白的陽性表達(dá)率比較見圖1、表1。細(xì)胞表面p75NGFR蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞膜呈綠色熒光。熒光顯微鏡下可清楚觀察到，與常規(guī)培養(yǎng)的對照組相比，在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)72 h后，膀胱癌細(xì)胞表面p75 NGFR蛋白均發(fā)生抑制，效應(yīng)熒光強(qiáng)度也隨之減弱。在2個(gè)細(xì)胞系缺氧24、48 h p75 NGFR蛋白表達(dá)陽性率有所下降，但與常氧組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在72 h與其余各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2不同培養(yǎng)條件下2種膀胱癌細(xì)胞中p75NGFRmRNA的表達(dá)見圖2、表2。瓊脂糖凝膠電泳顯示2個(gè)細(xì)胞系p75 NGFR在mRNA水平都有表達(dá)。2個(gè)細(xì)胞系p75 NGFR mRNA在缺氧24、48 h表達(dá)下降，但與常氧組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在72 h與其余各組相比，mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

上排：5637細(xì)胞；下排：SCaBER細(xì)胞；左：常氧；右：缺氧72 h圖1 不同培養(yǎng)條件下2種膀胱癌 細(xì)胞中p75 NGFR 蛋白表達(dá)的免疫熒光染色結(jié)果

*：與其余各時(shí)間點(diǎn)相比，P<0.05

1：DNA Marker；2～5：分別為常氧、缺氧24、48、72 h；上排：5637細(xì)胞；下排：SCaBER細(xì)胞圖2 不同培養(yǎng)條件下 2種膀胱癌細(xì)胞中p75 NGFR mRNA的表達(dá)

組別SCaBER細(xì)胞5637細(xì)胞常氧組1．50±0．071．01±0．06缺氧24h組1．45±0．050．96±0．03缺氧48h組1．40±0．050．92±0．05缺氧72h組0．85±0．06?0．58±0．06?F83．65251．496P<0．001<0．001

*：與其余各時(shí)間點(diǎn)相比，P<0.05

2.3不同培養(yǎng)條件下2種膀胱癌細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果見表3。

表3 不同培養(yǎng)條件下2種膀胱腫瘤細(xì)胞中凋亡率的變化(n=6) %

2.4不同培養(yǎng)條件下MMC對2種膀胱癌細(xì)胞抑制率的影響見表4。

表4 不同培養(yǎng)條件下MMC對 2種膀胱癌細(xì)胞抑制率的影響(n=6) %

3 討論

p75 NGFR屬于神經(jīng)生長因子低親和的受體。有研究[1]表明p75 NGFR在許多腫瘤組織中都有表達(dá)，其在惡性腫瘤中不僅可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移，也可抑制腫瘤，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，起到雙重調(diào)節(jié)的作用。Li等[2]發(fā)現(xiàn)p75 NGFR與食管癌的分期及淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)；有學(xué)者[3]研究認(rèn)為，p75 NGFR是膀胱癌和前列腺癌轉(zhuǎn)移的抑制基因，認(rèn)為p75 NGFR對腫瘤的抑制是通過抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡實(shí)現(xiàn)的。有學(xué)者[4]認(rèn)為p75 NGFR與腫瘤壞死因子受體蛋白超家族的結(jié)構(gòu)和序列具有同源性，屬于腫瘤壞死因子受體超家族，有細(xì)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域，可以連結(jié)相應(yīng)的信號通路引發(fā)細(xì)胞凋亡。p75 NGFR的表達(dá)可有選擇地影響細(xì)胞周期調(diào)節(jié)成分，以至于延遲了細(xì)胞從G1期進(jìn)入到有絲分裂的S期[5]。

研究[6]發(fā)現(xiàn)，實(shí)體瘤與其周圍的組織相比氧分壓是降低的，并且認(rèn)為缺氧是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)因子，目前發(fā)現(xiàn)在許多膀胱癌組織中氧含量較低。有研究[7]報(bào)道，膀胱癌中缺氧可以誘發(fā)血管增生和缺氧誘導(dǎo)因子-1的表達(dá)增加，而這些可以引起腫瘤的浸潤增加和復(fù)發(fā)。Ord等[8]對膀胱癌研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的壞死率隨膀胱癌分期的增加而增加。有學(xué)者[9]認(rèn)為如果能夠?qū)θ毖跫?xì)胞進(jìn)行治療有可能提高腫瘤的局部控制和患者的長期生存率。探討腫瘤細(xì)胞在缺氧過程中細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，對研究腫瘤惡變及侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制有重要意義。本研究在體外模擬缺氧環(huán)境，觀察膀胱癌細(xì)胞在缺氧環(huán)境下表面蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步研究p75 NGFR在膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移以及治療抵抗上的作用提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p75 NGFR在不同分化來源的膀胱癌細(xì)胞上均有表達(dá)，并且在缺氧條件下p75 NGFR蛋白表達(dá)陽性率及mRNA在2個(gè)細(xì)胞系隨著缺氧時(shí)間的延長表達(dá)均呈逐漸下降趨勢。免疫熒光染色也證實(shí)膀胱癌細(xì)胞表面p75 NGFR蛋白在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)72 h后均發(fā)生抑制效應(yīng)，熒光強(qiáng)度也隨之減弱。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在缺氧環(huán)境下不同分化的膀胱癌細(xì)胞從表面蛋白及內(nèi)在的RNA水平均有變化。缺氧環(huán)境下膀胱癌細(xì)胞的凋亡結(jié)果顯示，膀胱癌細(xì)胞SCaBER、5637在缺氧第3天開始凋亡率低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果與目前報(bào)道的缺氧抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡相一致[10]。膀胱癌藥物敏感試驗(yàn)顯示缺氧環(huán)境下MMC對膀胱癌細(xì)胞SCaBER和5637的抑制率低于常氧組，隨著時(shí)間延長差異越明顯，說明缺氧條件下膀胱癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性下降。

綜上所述，缺氧條件下膀胱癌細(xì)胞的凋亡及對化療藥物的敏感性發(fā)生變化，說明缺氧可以導(dǎo)致膀胱癌的生物學(xué)特性發(fā)生改變，這與膀胱癌的惡性度的變化以及侵襲和轉(zhuǎn)移之間有無關(guān)聯(lián)需要進(jìn)一步研究。

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