APTO-253對(duì)紫杉醇或順鉑處理的卵巢癌SKOV3及OVCAR3細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

王寶金，申愛(ài)榮，付喜玲，李 霞，王新月，任琛琛

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052

目前腫瘤切除術(shù)及術(shù)后輔以鉑類藥物(順鉑)聯(lián)合紫杉醇為主的基礎(chǔ)化療是標(biāo)準(zhǔn)的卵巢癌治療方法。但是因卵巢癌起病隱匿，大多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期；并且該病極易發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，手術(shù)難以根除，術(shù)后易復(fù)發(fā)。APTO-253在美國(guó)已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于一些實(shí)體腫瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)。既往的研究[1]證實(shí)APTO-253在人類結(jié)腸癌、白血病、腎癌和前列腺癌等癌細(xì)胞系中具有抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的作用，能夠阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為了了解小分子誘導(dǎo)劑APTO-253在卵巢癌細(xì)胞中對(duì)化療藥物療效的影響，作者觀察了APTO-253對(duì)紫杉醇或順鉑處理的SKOV3及OVCAR3細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑及儀器卵巢癌細(xì)胞株：自美國(guó)菌種中心購(gòu)買(mǎi)的SKOV3和OVCAR3細(xì)胞株。主要試劑：紫杉醇、順鉑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)于美國(guó)HyClone公司；Caspase-3/7試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；P21、cMyc、CDK6、剪切后的聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(Cleaved-PARP)、剪切后的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-Caspase-3)一抗抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司，二抗抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。Western blot蛋白印跡轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于美國(guó)伯樂(lè)公司，蛋白印跡電泳儀購(gòu)于美國(guó)英杰公司；熒光免疫顯微鏡購(gòu)于日本尼康公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)取出細(xì)胞凍存管，分別將完全溶解的SKOV3和OVCAR3細(xì)胞(各1 mL)加入3 mL含有體積分?jǐn)?shù)10%已滅活胎牛血清和100 U/mL青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.3SKOV3和OVCAR3細(xì)胞凋亡及Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3和OVCAR3細(xì)胞種植于96孔板中，8 000個(gè)/孔，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，體積分?jǐn)?shù)10% DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞饑餓后，分別加入5 μmol/L APTO-253、4 mg/L順鉑或40 nmol/L紫杉醇、5 μmol/L APTO-253聯(lián)合4 mg/L順鉑或40 nmol/L紫杉醇的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，采用Caspase-3/7活性方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果以熒光強(qiáng)度表示。6孔板培養(yǎng)SKOV3和OVCAR3細(xì)胞，分組及處理方法同上，提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度并配平及變性，進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉、一抗(Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase-3)及二抗(兔抗人)孵育、顯色曝光，分析SKOV3和OVCAR3細(xì)胞Cleaved-PARP及Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

1.4APTO-253處理后SKOV3和OVCAR3細(xì)胞周期及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(P21、cMyc、CDK6)表達(dá)水平的檢測(cè)用6孔板培養(yǎng)SKOV3和OVCAR3細(xì)胞，饑餓24 h，用含5 μmol/L APTO-253的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)細(xì)胞24 h，取2×106個(gè)細(xì)胞懸浮于5 mL PBS中，離心后重懸細(xì)胞。轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至含體積分?jǐn)?shù)70%乙醇的離心管中離心后，于5 mL PBS中懸浮沉淀細(xì)胞，等待60 s，離心5 min。在1 mL PI染色溶液中懸浮沉淀細(xì)胞，在室溫下孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。在SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中分別于含5 μmol/L APTO-253的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液處理細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、3、6、12、24 h)收集、裂解細(xì)胞，測(cè)定蛋白濃度并配平及變性，進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉、一抗(P21、cMyc、CDK6)和二抗(兔抗人及鼠抗人)孵育、顯色曝光，分析細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P21、cMyc、CDK6的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。不同處理組間SKOV3、OVCAR3細(xì)胞凋亡情況的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析；空白對(duì)照組和APTO-253組間細(xì)胞周期的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1APTO-253聯(lián)合化療藥物紫杉醇或順鉑處理后SKOV3和OVCAR3細(xì)胞凋亡及Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè)SKOV3和OVCAR3細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1、2，Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖1。

表1 APTO-253和紫杉醇單獨(dú)及聯(lián)合處理后SKOV3、OVCAR3細(xì)胞凋亡情況的比較(n=3)

SKOV3細(xì)胞：FAPTO-253=237.671，F(xiàn)紫杉醇=479.768，F(xiàn)交互=237.671，P均<0.001；OVCAR3細(xì)胞：FAPTO-253=84.439，F(xiàn)紫杉醇=910.963，F(xiàn)交互=20.944，P均<0.001

表2 APTO-253和順鉑單獨(dú)及聯(lián)合處理后SKOV3、OVCAR3細(xì)胞凋亡情況的比較(n=3)

SKOV3細(xì)胞：FAPTO-253=124.026，F(xiàn)順鉑=667.161，F(xiàn)交互=50.658，P均<0.001；OVCAR3細(xì)胞：FAPTO-253=256.013，F(xiàn)順鉑=14 819.557，F(xiàn)交互=138.311，P均<0.001

2.2APTO-253誘導(dǎo)后SKOV3和OVCAR3細(xì)胞周期、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(P21、cMyc、CDK6)表達(dá)的檢測(cè)APTO-253處理后SKOV3和OVCAR3細(xì)胞周期的變化見(jiàn)表3、4?？芍?，APTO-253可導(dǎo)致G1期阻滯，S期和G2/M期細(xì)胞減少。不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(P21、cMyc、CDK6)表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2?？芍?，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK6和cMyc表達(dá)水平下降，而P21蛋白表達(dá)水平升高。

1：空白組；2：5 μmol/L APTO-253組；3：40 nmol/L紫杉醇組；4：5 μmol/L APTO-253聯(lián)合40 nmol/L紫杉醇組；5：4 mg/L順鉑組；6：5 μmol/L APTO-253聯(lián)合4 mg/L順鉑組圖1 APTO-253、紫杉醇(或順鉑)及 兩者聯(lián)合處理后SKOV3和OVCAR3細(xì)胞 Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3表達(dá)的檢測(cè)

表4 APTO-253誘導(dǎo)后OVCAR3細(xì)胞周期的改變 %

圖2 APTO-253誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn) SKOV3和OVCAR3細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

3 討論

卵巢癌易早期侵襲轉(zhuǎn)移，易復(fù)發(fā)，且對(duì)化療藥物耐藥，病死率位于女性生殖系統(tǒng)腫瘤首位。目前卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確，因此如何增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高治療效果及患者的生存率和生活質(zhì)量，逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。APTO-253是一種小分子化合物，在美國(guó)已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于一些實(shí)體腫瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)[1]。

Cleaved-Caspase-3是活化的Caspase-3被剪切后產(chǎn)生的活性片段，其表達(dá)情況可真實(shí)反映機(jī)體Caspase-3的活性狀態(tài)及細(xì)胞凋亡情況。有學(xué)者[2]報(bào)道，在直腸癌中高水平Cleaved-Caspase-3的患者預(yù)后較好，Cleaved-Caspase-3低水平與直腸癌的復(fù)發(fā)有關(guān)。Donato等[3]研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中Cleaved-Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率下降；進(jìn)一步的研究[4]發(fā)現(xiàn)Cleaved-Caspase-3表達(dá)水平與宮頸癌組織分化程度有關(guān)，即其表達(dá)隨著組織分化程度的增加而明顯降低。Cleaved-PARP執(zhí)行細(xì)胞凋亡的功能[5]，是細(xì)胞凋亡的生物學(xué)標(biāo)志。王瑩等[6]探討了硼替佐米誘導(dǎo)VSMC凋亡的機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同濃度藥物干預(yù)下Pro-Caspase-3表達(dá)降低而Cleaved-PARP表達(dá)升高。本研究中采用Caspase-3/7活性方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用Western blot方法檢測(cè)Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)APTO-253誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡增加，Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP的表達(dá)明顯增高，說(shuō)明APTO-253可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；經(jīng)APTO-253聯(lián)合化療藥物處理后細(xì)胞凋亡顯著增加，Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP的表達(dá)明顯增高，表明APTO-253可協(xié)同增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

細(xì)胞周期的異常調(diào)控使細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)生紊亂，是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因之一[7]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)APTO-253誘導(dǎo)的SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中G1期細(xì)胞受到阻滯，S期和G2/M期細(xì)胞顯著減少。CDK6被認(rèn)為是一種癌基因[8]，參與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖[9-10]。有學(xué)者[11]報(bào)道CDK6在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)升高。作者發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞中APTO-253可下調(diào)CDK6的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，且具有時(shí)間依賴性。cMyc是常見(jiàn)的控制細(xì)胞增殖和分化的原癌基因，研究[12]發(fā)現(xiàn)在漿液性卵巢腺癌及FIGO Ⅲ期以上卵巢癌組織中cMyc過(guò)度表達(dá)，提示cMyc可能與卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示在卵巢癌細(xì)胞中經(jīng)APTO-253誘導(dǎo)后cMyc的表達(dá)明顯下調(diào)，表明APTO-253可以抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。p21是一種抑癌基因，在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)降低，與組織學(xué)分級(jí)、轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小相關(guān)[13-14]，且與FIGO分期密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，在卵巢癌細(xì)胞中經(jīng)APTO-253誘導(dǎo)后P21表達(dá)水平升高。總之，APTO-253可以阻滯卵巢癌細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并具有時(shí)間依賴性。

綜上所述，在SKOV3和OVCAR3卵巢癌細(xì)胞中APTO-253能夠?qū)е录?xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，聯(lián)合順鉑及紫杉醇使用有協(xié)同作用，能增強(qiáng)化療藥物的療效。作者推測(cè)，APTO-253聯(lián)合化療藥物可能是治療卵巢癌的新策略，將促進(jìn)卵巢癌治療臨床試驗(yàn)的轉(zhuǎn)變。

[1] CERCEK A,WHELER J,MURRAY PE,et al.Phase 1 study of APTO-253 HCl, an inducer of KLF4, in patients with advanced or metastatic solid tumors[J].Invest New Drugs,2015,33(5):1086

[2] NOBLE P,VYAS M,AL-ATTAR A,et al.High levels of cleaved caspase-3 in colorectal tumour stroma predict good survival[J].Br J Cancer,2013,108(10):2097

[3] DONATO AL,HUANG Q,LIU X,et al.Caspase 3 promotes surviving melanoma tumor cell growth after cytotoxic therapy[J].J Invest Dermatol,2014,134(6):1686

[4] MAO P,SMITH L,XIE W,et al.Dying endothelial cells stimulate proliferation of malignant glioma cells via a caspase 3-mediated pathway[J].Oncol Lett,2013,5(5):1615

[5] SHALINI S,DORSTYN L,DAWAR S,et al.Old, new and emerging functions of caspases[J].Cell Death Differ,2015,22(4):526

[6] 王瑩,魏會(huì)麗,孫瑞紅.硼替佐米對(duì)人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(19):3155

[7] KOLLMANN K,HELLER G,SCHNECKENLEITHNER C,et al.A kinase-independent function of CDK6 links the cell cycle to tumor angiogenesis[J].Cancer Cell,2013,24(2):167

[8] KOHRT D,CRARY J,ZIMMER M,et al.CDK6 binds and promotes the degradation of the EYA2 protein[J].Cell Cycle,2014,13(1):62

[9] KAWASAKI Y,KOMIYA M,MATSUMURA K,et al.MYU, a target lncRNA for Wnt/c-Myc signaling, mediates induction of CDK6 to promote cell cycle progression[J].Cell Rep,2016,16(10):2554

[10]ZHU K,LIU L,ZHANG J,et al.MiR-29b suppresses the proliferation and migration of osteosarcoma cells by targeting CDK6[J].Protein Cell,2016,7(6):434

[11]凌晨,劉蜀,王勇,等.CDK6在早期卵巢癌中表達(dá)及其臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,36(9):1271

[12]NESBIT CE,TERSAK JM,PROCHOWNIK EV.MYC oncogenes and human neoplastic disease[J].Oncogene,1999,18(19):3004

[13]秦瑞,劉俊寶,曹璐,等.卵巢上皮性癌組織中P21蛋白的表達(dá)及其臨床意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,38(1):98

[14]劉偉,劉海燕,許喆菲,等.p21WAF1基因與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2012,41(1):102

[15]張軍,汪瑞雪,樊曉妹,等.卵巢漿液性腺癌中SP1、KLF4和p21表達(dá)及其預(yù)后意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2017,33(1):22