氯氣吸入致大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體損傷及紅景天苷的干預(yù)作用

劉萌萌，李彥文，周慶彪，張佳欣，王樂樂，劉江正，于衛(wèi)華，孔德欽，

劉 瑞，海春旭，張曉迪*

（空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系毒理學(xué)教研室，陜西 西 安 710032）

氯氣廣泛用于冶金、紙漿漂白、紡織、染料、橡膠、塑料等工業(yè)生產(chǎn)，由于管理不善或操作不當(dāng)所導(dǎo)致的群體性急性中毒事件時(shí)有發(fā)生[1]。肺臟是氯氣發(fā)揮毒效應(yīng)的第一靶器官，高濃度氯氣可深入肺泡，引起急性肺損傷(acute lung injury，ALI），目前缺乏救治藥物。研究顯示，線粒體在氯氣引起的II型肺泡上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，并能影響整個(gè)細(xì)胞的功能，從而加重ALI[2]，提示改善線粒體功能可能是治療氯氣致ALI的有效途徑。PINK1/Parkin是線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白，通過影響自噬、離子運(yùn)輸和ATP產(chǎn)量等作用，保護(hù)線粒體的完整性[3-4]。紅景天苷是一種苯丙素糖苷，自紅景天中提取，具有提高運(yùn)動(dòng)耐力、抗疲勞、預(yù)防高原反應(yīng)、促進(jìn)血液循環(huán)、清除機(jī)體毒素和治療各種地方病等藥理作用。本研究在深入觀察氯氣致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的基礎(chǔ)上，探討紅景天苷對(duì)氯氣暴露致大鼠急性肺損傷發(fā)生中線粒體功能的干預(yù)作用，為氯氣中毒的臨床救治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯氣購自常州市京華氣體有限公司。二辛可寧酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒和超微量ATPase測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；組織線粒體分離試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；Tom20鼠多克隆抗體、COX IV兔多克隆抗體、PINK1兔多克隆抗體和Parkin兔多克隆抗體均為美國Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品；β-actin鼠多克隆抗體購于美國Sigma公司；動(dòng)式染毒柜為天津合普科技有限公司產(chǎn)品。紅景天苷購自西安易樂生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物與飼養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(陜)2014-002。成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量為 (200±20) g，飲用自來水，墊料為鋸末，12 h/12 h明暗交替，在染毒前12 h禁食不禁水。

1.2.2 動(dòng)物分組和處理 36只雄性SD大鼠，氯氣暴露前1 d，隨機(jī)分為6組：分別為未染毒組，以及氯氣染毒后0.5、1.5、3、6和9 h組。各染毒組被置于染毒柜中給予氯氣1 200 mg/m3暴露處理5 min，未染毒組(給予空氣)單獨(dú)放入干凈染毒柜中，5 min后取出，在相應(yīng)時(shí)間取材，腹腔注射2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，后行氣管插管，結(jié)扎右側(cè)支氣管，左肺進(jìn)行肺泡灌洗。將未灌洗的右肺整體取出，右肺中葉用于病理切片制備，其余肺組織置-80 ℃ 保存待用。另外24只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為4組：氯氣暴露組，紅景天苷干預(yù)組，陰性對(duì)照組和紅景天苷對(duì)照組；氯氣暴露組和紅景天苷干預(yù)組氯氣染毒條件同上，其余2組未進(jìn)行染毒處理。紅景天苷干預(yù)組和紅景天苷對(duì)照組均于染毒前30 min和染毒后15 min各給予1次300 mg/kg紅景天苷灌胃，陰性對(duì)照組和氯氣暴露組給予等量生理鹽水灌胃，3 h后取材。

1.2.3 乳酸脫氫酶(LDH）、Na+, K+- ATP酶及Ca2+, Mg2+-ATP酶活力的測(cè)定 左肺灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和全血 2 000 r/min離心10 min，分裝后嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟，測(cè)定LDH活力、Na+, K+-ATP 酶及Ca2+, Mg2+-ATP酶活力，其余部分于-80 ℃保存。

1.2.4 Western blot檢測(cè)PINK1、Parkin和Tom20蛋白表達(dá) 取100 mg肺組織，剪碎后置于勻漿器中，加1 mL裂解液，勻漿后置于冰上裂解30 min，14 770 r/min 離心20 min，取上清，其中 20 μL用于蛋白定量，其余分別加入等體積2×SDS上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min，將樣品進(jìn)行分裝，-80 ℃保存，Western blot測(cè)定PINK1、Parkin和Tom20蛋白表達(dá)，使用Quantity One灰度分析軟件進(jìn)行半定量。

1.2.5 肺組織細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 取右肺中葉，4%戊二醛固定肺組織，二甲砷酸緩沖液沖洗后脫

水、環(huán)氧樹脂浸透、包埋、超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染，透射電鏡下觀察肺血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)改變。

1.2.6 肺組織線粒體的提取 準(zhǔn)確稱取200 mg肺組織，PBS沖洗干凈，加入線粒體分離試劑后勻漿器勻漿，1 000 r/min離心10 min，取上清，11 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清，沉淀即線粒體。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，-實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s 表示，組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 Tukey’s multiple comparison test檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 氯氣暴露引起B(yǎng)ALF中LDH活力升高

LDH的檢測(cè)結(jié)果見圖1，與未染毒組相比，氯氣暴露處理不同時(shí)間后，大鼠BALF中LDH活力均明顯升高，其差均異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。

圖1 氯氣暴露后大鼠BALF中LDH的變化

2.2 氯氣暴露影響線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot法檢測(cè)肺組織中線粒體相關(guān)蛋白Tom20、PINK1及Parkin表達(dá)結(jié)果見圖2。與未染毒組相比，Tom20、PINK1及Parkin蛋白表達(dá)水平均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05，Tom20蛋白9 h組除外)。與其他組別相比，染毒后3 h組Tom 20蛋白表達(dá)量最高(P＜0.05)，故選取3 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

2.3 氯氣致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化

圖2 氯氣染毒不同時(shí)間后大鼠肺組織線粒體相關(guān)蛋白Tom20、PINK1及Parkin表達(dá)變化

透射電鏡檢測(cè)大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)果見圖3。陰性對(duì)照組肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體(圖3A、B)形態(tài)正常，線粒體呈卵圓形或桿狀，分布密集，內(nèi)嵴清晰且排列整齊，嵴內(nèi)腔未見擴(kuò)張，基質(zhì)均勻一致，未見線粒體腫脹及空泡變性。氯氣暴露后3 h(圖3C)，肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體透光度不均，嵴排列紊亂，甚至溶解消失，基質(zhì)疏松，線粒體腫脹明顯且空泡變性(圖3D)。

2.4 紅景天苷對(duì)肺組織線粒體相關(guān)蛋白的干預(yù)作用

圖3 透射電鏡下大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)改變

Western blot檢測(cè)肺組織線粒體相關(guān)蛋白結(jié)果如圖4。氯氣暴露后3 h，大鼠肺組織PINK1和Parkin蛋白表達(dá)上調(diào)，與氯氣暴露組相比，紅景天苷可降低PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)。

2.5 紅景天苷對(duì)線粒體PINK1和Parkin的干預(yù)作用

圖4 紅景天苷對(duì)肺組織PINK1、Parkin蛋白表達(dá)的干預(yù)作用

PINK1和Parkin主要在線粒體上發(fā)揮作用，進(jìn)一步測(cè)定了線粒體中PINK1和Parkin的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果見圖5。與陰性對(duì)照組相比，氯氣暴露后，線粒體中PINK1蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，Parkin蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)；與氯氣暴露組比較，紅景天苷干預(yù)能夠顯著降低線粒體PINK1蛋白表達(dá)(P＜0.05)，升高Parkin蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)。

2.6 紅景天苷對(duì)肺組織ATP酶活力的干預(yù)作用

定磷法檢測(cè)ATPase活力結(jié)果見圖6。與陰性對(duì)照組相比，氯氣損傷后 3 h，引起肺組織Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活力升高(P＜0.05)。紅景天苷干預(yù)可顯著使其活性降低(P＜0.05)。

2.7 紅景天苷對(duì)血清LDH活力的干預(yù)作用

大鼠血清LDH活力變化情況如圖7。氯氣染毒后3 h，氯氣暴露組LDH活力顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05)；與氯氣暴露組相比，紅景天苷干預(yù)可顯著降低因氯氣損傷引起的LDH活力異常(P＜0.05)。提示紅景天苷對(duì)氯氣致急性肺損傷具有保護(hù)作用。

3 討論

氯氣是一種刺激性氣體，進(jìn)入機(jī)體后，常與黏膜和呼吸道的水作用生成氯化氫和新生態(tài)氧，引起上呼吸道黏膜炎性水腫、充血和壞死[5]。氯氣中毒至今缺乏有效救治藥物，瓶頸問題是中毒機(jī)制不清楚。本研究在大鼠染毒實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，氯氣損傷后可致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體受損，線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，并且染毒后3 h變化顯著。結(jié)合文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道，推測(cè)在氯氣致大鼠急性肺損傷過程中，線粒體損傷可能是其發(fā)生的重要環(huán)節(jié)和損傷機(jī)制。線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的氧化代謝場(chǎng)所，其膜上的呼吸酶類可通過電子傳遞鏈傳遞電子，消耗O2，產(chǎn)生ATP。生理狀態(tài)下，線粒體傳遞電子是高效的，僅有少量電子漏出，形成ROS。有研究報(bào)道，氯氣暴露后，次級(jí)代謝產(chǎn)物Cl/HClO/ClO-可直接作用于線粒體，損傷電子2鏈，引起內(nèi)源性ROS增多，并且消耗抗氧化物質(zhì)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[9]。本研究發(fā)現(xiàn)氯氣損傷過程中線粒體結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生顯著變化，這種變化是否是由過多的ROS所導(dǎo)致的，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。紅景天苷被認(rèn)為是紅景天中最有效成分[10]，分子式為C H O，親水14 20 7強(qiáng)，不易透過組織生物膜[11]，半衰期短，與組織有較高的親和性，可提高機(jī)體對(duì)氧的利用系數(shù)和對(duì)缺氧的耐受性，起到保護(hù)肺組織和心血管的作用[11]。紅景天苷還是良好的抗氧化劑，能夠清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化物形成，延緩細(xì)胞的退行性變化。本文嘗試應(yīng)用紅景天苷這種優(yōu)良的抗氧化劑驗(yàn)證改善氧化損傷的同時(shí)，是否可修復(fù)線粒體損傷。

圖5 紅景天苷對(duì)肺組織線粒體中PINK1和Parkin蛋白表達(dá)的干預(yù)作用

圖6 紅景天苷對(duì)肺組織ATP酶活力的干預(yù)作用

圖7 紅景天苷對(duì)大鼠血清LDH水平的干預(yù)作用

PTEN誘導(dǎo)假定激酶1 (PINK1)是一種核編碼的絲/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生，轉(zhuǎn)位至線粒體發(fā)揮作用[12-13]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激時(shí)，PINK1轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，以一種磷酸化的作用方式偶聯(lián)Parkin，從而維持線粒體膜的完整性和膜電位的穩(wěn)定。PINK1/Parkin是線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子[12，14]，具有保護(hù)細(xì)胞線粒體的功能。由于線粒體是細(xì)胞內(nèi)主要的產(chǎn)能細(xì)胞器，因此PINK1/Parkin對(duì)于細(xì)胞的活性也至關(guān)重要。PINK1的變異會(huì)導(dǎo)致激酶活力下降，影響自噬、氧化磷酸化和糖酵解水平[15-16]，Parkin可以與線粒體DNA 直接結(jié)合，保護(hù)線粒體 DNA并激發(fā)線粒體的自我修復(fù)過程[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，氯氣暴露引起肺組織PINK1與Parkin蛋白表達(dá)水平升高，這可能與線粒體數(shù)量增加有關(guān)；氯氣暴露引起線粒體PINK1轉(zhuǎn)位水平升高，偶聯(lián)Parkin下降，線粒體自噬水平下降，這與Zhang等[18]的研究結(jié)果一致，原因可能是受損線粒體增多，機(jī)體清除率下降[19]；紅景天苷干預(yù)可有效降低線粒體PINK1轉(zhuǎn)位水平，升高線粒體Parkin水平，說明紅景天苷可保護(hù)線粒體，這與張偉等[20]的研究結(jié)果一致，原因可能是，紅景天苷通過維持PINK1和Parkin功能，促進(jìn)失活線粒體的降解，抑制因氯氣暴露引起的線粒體數(shù)量升高。

肺泡表面存在ATP依賴的Na+, K+- ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶，在ALI進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[21]。氯氣暴露后，次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)胞直接作用于線粒體，干擾氧化磷酸化過程，引起ATP產(chǎn)量下降，影響ATPase 活性，導(dǎo)致肺泡離子運(yùn)輸紊亂。肺泡上皮的Na+, K+-ATP 酶，將Na+離子從肺泡腔轉(zhuǎn)移到肺泡間質(zhì)，當(dāng)肺泡上皮輕微受損時(shí)，Na+, K+-ATP酶被激活，可在一定程度上限制肺水腫的程度[22]， 隨著損傷加重，Na+, K+-ATP酶逐漸失活。Ca2+, Mg2+-ATP酶與鈣穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)。氯氣暴露后，ATP能量供應(yīng)異常，Ca2+, Mg2+-ATP酶功能異常，引起細(xì)胞外Ca2+內(nèi) 流和細(xì)胞質(zhì)Ca2+超載，引起離子代謝紊亂，導(dǎo)致肺水腫。本研究觀察到，氯氣暴露引起ATP酶活力升高，離子運(yùn)輸紊亂，這與Qin等[21]結(jié)果一致，紅景天苷干預(yù)可顯著降低ATP酶水平，提示紅景天苷對(duì)線粒體有保護(hù)作用。

LDH存在于人體各組織器官中，是機(jī)體能量代謝中的一種重要酶，其質(zhì)與量的改變，直接影響到機(jī)體的能量代謝。當(dāng)機(jī)體各組織器官病變時(shí)，其組織器官本身的LDH活力發(fā)生改變，并且可引起血液中LDH活力改變，因此LDH活力的改變反映了機(jī)體受損的程度。氯氣暴露后，肺組織LDH被釋放進(jìn)入血清和BALF中，LDH活力水平可間接反映肺損傷程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯氣暴露引起LDH活力升高，紅景天苷能夠有效抑制LDH活性的升高，提示紅景天苷可有效保護(hù)氯氣引起的大鼠ALI。

綜上所述，氯氣暴露引起大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體受損，致細(xì)胞供能障礙，肺血管功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致急性肺損傷。紅景天苷可改善氯氣所致的大鼠ALI，其機(jī)制除了改善氧化損傷外，還可能通過抑制線粒體過度增殖，同時(shí)促進(jìn)受損線粒體的清除來發(fā)揮作用。本研究為紅景天苷藥物藥效學(xué)研究及氯氣中毒的有效救治提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與理論依據(jù)，為紅景天苷的藥物開發(fā)提供了有意義的參考。

[1] Van SICKLE D，WENCK M A，BELFLOWER A，et al. Acute health effects after exposure to chlorine gas released after a train derailment[J]. Am J Emerg Med，2009，27(1)：1-7.

[2] JURKUVENAITE A，BENAVIDES G A，KOMAROVA S，et al. Upregulation of autophagy decreases chlorine gas induced mitochondrial injury and lung inflammation[J]. Free Radic Biol Med，2015，85：83-94.

[3] DEAS E，PLUN-FAVREAU H，WOOD N W. PINK1 function in health and disease[J]. Embo Mol Med，2009，1(3)：152-165.

[4] SCARFFE L A，STEVENS D A，DAWSON V L，et al. Parkin and PINK1：much more than mitophagy[J]. Trends Neurosci，2014，37(6)：315-324.

[5] 張曉迪，趙琰，李文麗，等. 紅景天苷對(duì)氯氣致大鼠肺損傷的保護(hù)作用[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2013，29(4)：269-272.[6] 尚濤，李立萍，張建新. 線粒體與急性肺損傷[J]. 河北醫(yī)藥，2007，29(4)：367-369.

[7] ISLAM M N，DAS S R，EMIN M T，et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury[J]. Nat Med，2012，18(5)：759-765.

[8] 焦光宇，畢濤，高鴻美，等. 內(nèi)毒素對(duì)大鼠膈肌收縮功能及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31(6)：431-435.

[9] 劉萌萌，孔德欽，鄒遠(yuǎn)康，等. 紅景天苷對(duì)氯氣暴露致急性肺損傷肺血管通透性的保護(hù)作用[J]. 癌變·畸變·突變，2016，28(5)：377-382.

[10] ZHONG H，XIN H，WU L X，et al. Salidroside attenuates apoptosis in ischemic cardiomyocytes：a mechanism through a mitochondria-dependent pathway[J]. J Pharmacol Sci，2010，114(4)：399-408.

[11] 章娟. 大花紅景天質(zhì)量控制和相關(guān)成分藥代動(dòng)力學(xué)研究[D].沈陽：沈陽藥科大學(xué)，2008.

[12] VALENTE E M，ABOU-SLEIMAN P M，CAPUTO V，et al.Hereditary early-onset Parkinson's disease caused by mutations in PINK1[J]. Science，2004，304(5674)：1158-1160.

[13] BEILINA A，Van Der BRUG M，AHMAD R，et al. Mutations in PTEN-induced putative kinase 1 associated with recessive parkinsonism have differential effects on protein stability[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(16)：5703-5708.

[14] KITADA T，ASAKAWA S，HATTORI N，et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism[J]. Nature，1998，392(6676)：605-608.

[15] GEGG M E，COOPER J M，SCHAPIRA A H，et al. Silencing of PINK1 expression affects mitochondrial DNA and oxidative phosphorylation in dopaminergic cells[J]. PLoS One，2009，4(3)：e4756.

[16] MORAIS V A，VERSTREKEN P，ROETHIG A，et al.Parkinson’s disease mutations in PINK1 result in decreased complex I activity and deficient synaptic function[J]. Embo Mol Med，2009，1(2)：99-111.

[17] ROTHFUSS O，F(xiàn)ISCHER H，HASEGAWA T，et al. Parkin protects mitochondrial genome integrity and supports mitochondrial DNA repair[J]. Hum Mol Genet，2009，18(20)：3832-3850.

[18] ZHANG H，MI L，WANG T，et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy play a protective role in manganese induced apoptosis in SH-SY5Y cells[J]. Toxicol in Vitro，2016，34：212-219.

[19] NARENDRA D P，JIN S M，TANAKA A，et al. PINK1 is selectively stabilized on impaired mitochondria to activate Parkin[J]. PLoS Biol，2010，8(1)：e1000298.

[20] 張偉，李濤，陳磊，等. 紅景天苷通過PINK1-Parkin通路在MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中維持線粒體形態(tài)和功能[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16(9)：1649-1653.

[21] QIN X，LI Y，LIANG X，et al. The dysfunction of ATPases due to impaired mitochondrial respiration in phosgene-induced pulmonary edema[J]. Biochem Bioph Res Co，2008，367(1)：150-155.

[22] MCMAHON S，CHARBONNEAU M，GRANDMONT S，et al.Transforming growth factor beta1 induces hypoxia-inducible factor-1 stabilization through selective inhibition of PHD2 expression[J]. J Biol Chem，2006，281(34)：24171-24181.