納米鎳對(duì)大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡作用及機(jī)制研究

高曉潔 孔 璐* 薛玉英*

（1. 東 南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南 京 210009；2. 江 蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南 京 210009）

納米鎳作為一種金屬納米材料，除具備納米粒子自身性質(zhì)之外，還具有一系列磁、電、光及力學(xué)等方面的新異特性，已經(jīng)被應(yīng)用到各種消費(fèi)產(chǎn)品和行業(yè)中，如催化劑、陶瓷、潤(rùn)滑劑、涂料、電子和燃料[1]，在鎳氫電池、太陽(yáng)能涂層、集成電路、靶向藥物載體、磁共振成像、腫瘤熱療、磁療保健產(chǎn)品等領(lǐng)域[1-2]具有廣泛的應(yīng)用，使其通過(guò)不同途徑進(jìn)入人體的機(jī)會(huì)大大增加，對(duì)機(jī)體的影響越來(lái)越引起人們的重視。研究[3-7]表明納米鎳可引起氧化應(yīng)激、細(xì)胞毒性、細(xì)胞周期改變、細(xì)胞凋亡以及DNA損傷等反應(yīng)。研究[8]還顯示納米材料的超微性使其可以輕松通過(guò)血睪屏障，引起生殖細(xì)胞損害。本課題組前期研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，納米鎳對(duì)大鼠和線(xiàn)蟲(chóng)均具有生殖毒性作用，尤其對(duì)雄性大鼠生殖細(xì)胞具有明顯損害。研究[11-13]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，是一類(lèi)長(zhǎng)度一般超過(guò)200 nt的非蛋白編碼RNA，主要從表觀(guān)遺傳、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等層面調(diào)控基因表達(dá)。LncRNA與生殖發(fā)育及細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，但lncRNA在環(huán)境污染物所致生殖損傷中的作用及其機(jī)制研究報(bào)道極少。因此，本研究應(yīng)用SD大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討納米鎳對(duì)大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的作用，以及凋亡相關(guān)lncRNA的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

納米鎳，粒徑90 nm，產(chǎn)品代號(hào)FNiN-80，黑色粉體，純度99%，比表面積≥8 m3/g，松裝密度0.06～0.80 g/cm3，購(gòu)自昆山密友納米科技有限公司。22～28 d齡SPF級(jí)雄性SD大鼠8只，每個(gè)實(shí)驗(yàn)2只，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2013-0016。DMEM高糖培養(yǎng)液，購(gòu)于美國(guó)GE公司；Schiff試劑，購(gòu)于北京Solarbio科技有限公司，噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒，購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。主要儀器：3423型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公 司 )， FSX型 生 物 導(dǎo) 航 儀 (日 本Olympus公司)，Epoch型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司)，F(xiàn)ACSCantoTMII流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 納米鎳的表征 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制納米鎳溶液滴在銅網(wǎng)上，使用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果用Nano Measurer 1.2.5軟件分析納米鎳粒徑分布。

1.2.2 大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞的提取取22～28 d雄性SD大鼠2只，頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒陰囊皮膚，取雙側(cè)睪丸，放入預(yù)冷的D-Hank’s液中。剝除睪丸被膜，將實(shí)質(zhì)剪碎成約1 mm3大小，加入D-Hank’s 液靜置3 min，用D-Hank’s液沖洗2遍后轉(zhuǎn)入三角燒瓶中。加0.25%的胰酶6 mL，37 ℃恒溫水浴振蕩30 min，至組織碎塊變成線(xiàn)索狀。加入少許血清終止消化，1 000 r/min離心5 min，2次。D-Hank’s液洗滌沉淀后加入0.1%膠原酶，37 ℃恒溫低速振蕩30 min。75 μm細(xì)胞篩過(guò)濾，將濾液800 r/min離心5 min，2次，用DMEM培養(yǎng)液洗滌，加入一定量培養(yǎng)液重懸沉淀物，吹打混勻。將細(xì)胞置于飽和濕度、37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育[14]。

1.2.3 大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定在Feulgen染色法的基礎(chǔ)上將鹽酸水解的濃度、溫度和時(shí)間進(jìn)行了一定的改進(jìn)。生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，將共培養(yǎng)細(xì)胞爬片用PBS浸洗2次，95%酒精室溫固定15 min，蒸餾水洗片。置于25℃、5 mol/L鹽酸中30 min，蒸餾水沖洗2 min。加入Schiff試劑，37 ℃恒溫箱放置50 min。0.5%偏重亞硫酸水洗3次，每次5 min。流水沖洗5 min，蒸餾水沖洗2 min。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。生物導(dǎo)航儀下觀(guān)察結(jié)果，依據(jù)細(xì)胞形態(tài)鑒定生精細(xì)胞和支持細(xì)胞。

1.2.4 納米鎳染毒液的配制 設(shè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組不做處理，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的納米鎳溶液。納米鎳染毒液配制方法如下：稱(chēng)取一定量的納米鎳粉體，使用DMEM培養(yǎng)液配置成800 μg/mL 的儲(chǔ)備液，超聲(100 W)分散30 min后使用0.22 μm濾器(美國(guó)Millipore公司)過(guò)濾除菌，4 ℃保存1周使用。檢測(cè)前將納米鎳儲(chǔ)備液超聲分散30 min，使用DMEM培養(yǎng)液將儲(chǔ)備液分別稀釋到400、200、100、50和25 μg/mL。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞接種于96孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入5、50、100、200、400和800 μg/mL納米鎳溶液，每組設(shè)定4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后吸去染毒液，將MTT溶液使用不含血清的培養(yǎng)液稀釋至0.5 mg/mL，每孔加入200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 mL的DMSO，輕微振蕩，使結(jié)晶充分溶解。采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度D(490)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：

細(xì) 胞 存 活 率(%)=[D(490)實(shí)驗(yàn)組- D(490)空白組] /[D(490)對(duì)照組-D(490)空白組]×100%

1.2.6 Hoechst33258染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)將生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入25、50、100、200 μ g/mL納米鎳溶液，每組設(shè)定4個(gè)復(fù)孔。24 h 后，棄培養(yǎng)液，加入0.5 m L固定液，固定10 min或更長(zhǎng)時(shí)間(可4 ℃過(guò)夜)。去除固定液，PBS洗兩次，每次3 m in。0.5 m L H oechst33258染液染色5 m in。去染色液，PBS洗兩次，每次3 min。滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上已貼附細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液。生物導(dǎo)航儀觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，對(duì)照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入 25、50、100和200、400 μg/mL納米鎳溶液。每組4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。染毒結(jié)束后，棄染毒液，PBS清洗2次，每孔加入300 μL不含EDTA的胰酶消化，1 min后加600 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。細(xì)胞收集于EP管中，1 000 r/min離心10 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次。將細(xì)胞懸浮于200 μL結(jié)合緩沖液中，加入5 μL的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和5 μL碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，進(jìn)行雙染，室溫避光反應(yīng)15 min。加入200 μL結(jié)合緩沖液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，Annexin V-FITC的綠色熒光通過(guò)FL1通道檢測(cè)，PI紅色熒光通過(guò)FL2通道檢測(cè))。1.2.8 LncRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè) 染毒24 h后，對(duì)照組和100 μg/mL納米鎳染毒組(根據(jù)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)100 μg/mL納米鎳染毒組的凋亡率與對(duì)照組比較有顯著性差異，但又不會(huì)產(chǎn)生過(guò)高毒性，符合基因芯片檢測(cè)要求)分別加入1 mL Trizol收集細(xì)胞；使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)D(260)/D(280)值，以評(píng)估總RNA的純度，使用標(biāo)準(zhǔn)變性瓊脂糖膠凝電泳檢測(cè)總RNA的完整性；送至上海高通生物科技有限公司進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)用SPSS for Windows 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。多組間的比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。劑量效應(yīng)分析，采用兩變量直線(xiàn)相關(guān)分析(bivariate correlation)。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較時(shí)，若方差齊，采用LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，采用Games-Howell檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 納米鎳表征結(jié)果

掃描電子顯微鏡觀(guān)察，納米鎳呈球形，粒徑在30～100 nm，有一定團(tuán)聚。透射電子顯微鏡觀(guān)察，納米鎳呈規(guī)則球狀，粒徑分布不均勻，在25～125 nm ，有一定團(tuán)聚。如圖1所示。

圖1 納米鎳電子顯微鏡觀(guān)察圖

2.2 Feulgen染色法鑒定生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞

Feulgen染色結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖所示，支持細(xì)胞形狀不規(guī)則，胞體較大，胞核呈橢圓形，胞質(zhì)呈網(wǎng)狀，核仁區(qū)著色較淡，紫色的細(xì)胞核內(nèi)清晰可見(jiàn)染成深紫色的雙極小體；生精細(xì)胞呈圓形或卵圓形，胞核較大，胞質(zhì)極少，圓形或卵圓形的核占據(jù)了整個(gè)細(xì)胞體積的 90%。

2.3 納米鎳對(duì)大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響

不同濃度納米鎳染毒大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率變化如圖3所示。大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞暴露于不同劑量的納米鎳24 h后，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性下降(P＜0.01，r=0.784)。與對(duì)照組比較，所有劑量組細(xì)胞存活率均降低(P＜0.01)。

圖2 Feulgen染色法鑒定生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞(×200)

圖3 納米鎳染毒后大鼠生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞存活率的改變(，n=4)

2.4 納米鎳對(duì)SD大鼠生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的影響

Hoechst33258染色后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)固縮。所以染色時(shí)，細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。如圖4所示，倒置顯微鏡下觀(guān)察，對(duì)照組細(xì)胞(圖4A)呈正常藍(lán)色，細(xì)胞核內(nèi)DNA分布相對(duì)均勻，細(xì)胞核無(wú)固縮，在視野中呈現(xiàn)體積較大的且染色顏色較淺的核形態(tài)。處理組細(xì)胞(圖4B、C、D、E)細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的固縮、染色質(zhì)聚集、邊緣化等典型的細(xì)胞凋亡核形態(tài)學(xué)改變。

2.5 納米鎳對(duì)大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡率的影響

如圖5所示，在Annexin V/PI雙染法流式檢測(cè)結(jié)果中，不同濃度納米鎳染毒大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞總凋亡率的改變見(jiàn)圖6。與對(duì)照組相比，染毒24 h后，隨著染毒劑量的升高，細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴(lài)性增加(P＜0.01，r=0.844)：染毒劑量為25、50、100、200、400 μg/mL時(shí)，其凋亡率分別為8.80%±0.50%、11.00%±0.70%、12.53%±0.71%、15.95%±0.54%和17.80%±0.76%，且各劑量組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組(2.65%±0.74%)比較均明顯增加(P＜0.01)。

2.6 總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞樣品提取的總RNA進(jìn)行吸光度D(260)值測(cè)定，樣本濃度分別為344.9和346.1 ng/μL，具體結(jié)果見(jiàn)表1，RNA總量及質(zhì)量符合lncRNA微陣列的檢測(cè)要求?？俁NA經(jīng)瓊脂糖電泳后，可見(jiàn)18 S和28 S兩條清晰的條帶(圖7)，證實(shí)已經(jīng)獲得高純度完整的總RNA。

圖4 Hoechst33258染色法觀(guān)察納米鎳對(duì)大鼠生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的影響(×250)

圖5 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)不同劑量納米鎳對(duì)大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡率的影響

圖6 納米鎳對(duì)大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞總凋亡率的影響(n=4，)

圖7 細(xì)胞總RNA瓊脂糖電泳結(jié)果

表1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.7 凋亡相關(guān)lncRNA挑選結(jié)果

基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，涉及的凋亡相關(guān)通路有PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Gap junction信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、Chemokine信號(hào)通路、TGF-beta信號(hào)通路，Protein processing in endoplasmic reticulum信號(hào)通路和Jak-STAT信號(hào)通路。其中，參與這些凋亡通路的lncRNA共169個(gè)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，上調(diào)的有117個(gè)，下調(diào)的有52個(gè)(倍數(shù)絕對(duì)值≥2.0，P≤0.05)。本研究在前期芯片檢測(cè)基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，從中挑選凋亡相關(guān)lncRNA，為進(jìn)一步的功能及機(jī)制研究提供參考。

圖8 凋亡相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本文選擇大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)研究納米鎳對(duì)睪丸細(xì)胞的凋亡作用，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步探討納米鎳生殖損害作用的分子機(jī)制問(wèn)題。本研究首先建立大鼠睪丸生精-支持細(xì)胞原代共培養(yǎng)模型，并在Feulgen染色法基礎(chǔ)上進(jìn)行一定的改進(jìn)，對(duì)生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)本研究所建立的生精-支持細(xì)胞體系中支持細(xì)胞形狀不規(guī)則，胞體較大、胞核呈橢圓形、胞質(zhì)呈網(wǎng)狀、核仁區(qū)著色較淡，紫色的細(xì)胞核內(nèi)清晰可見(jiàn)染成深紫色的雙極小體；而生精細(xì)胞呈圓形或卵圓形，胞核大，胞質(zhì)極少，核占據(jù)絕大部分細(xì)胞體積。結(jié)果表明本課題建立的大鼠睪丸生精-支持細(xì)胞原代共培養(yǎng)模型與資料和其他文獻(xiàn)是相符的，可以應(yīng)用于其他研究。本課題應(yīng)用MTT法檢測(cè)大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞活性、Hoechst33258染色法和Annexin V-FITC法檢測(cè)了納米鎳對(duì)大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡作用的影響，發(fā)現(xiàn)納米鎳能引起大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞存活率的下降，并表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系；同時(shí)，導(dǎo)致大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡率的顯著性增加，且在高劑量時(shí)(400 μg/mL)時(shí)，凋亡細(xì)胞大量出現(xiàn)，凋亡率達(dá)17.8%。lncRNA基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示與凋亡相關(guān)的LncRNA共169個(gè)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，上調(diào)的有117個(gè)，下調(diào)的有52個(gè)。接著建立lncRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)lncRNA共表達(dá)的miRNA和mRNA進(jìn)行分析，從而明確lncRNA對(duì)關(guān)鍵信號(hào)通路的調(diào)控作用不僅可深入探討環(huán)境污染物毒性作用的調(diào)控機(jī)制，更重要的是為疾病的預(yù)防、診斷和治療提供可能的有潛力的生物標(biāo)志和治療靶標(biāo)。

在本課題組前期的研究當(dāng)中，體內(nèi)研究表明[9]納米鎳對(duì)雄性SD大鼠有生殖毒性，可損傷大鼠睪丸結(jié)構(gòu)和精子運(yùn)動(dòng)功能。納米鎳誘導(dǎo)秀麗線(xiàn)蟲(chóng)生殖毒性的結(jié)果表明，與微米鎳相比較，納米鎳具有更高的生殖毒性，包括育雛數(shù)量減少，受精卵和精子激素活化，世代時(shí)間和不成熟的精子細(xì)胞增加[10]。 Gallo等[15]研究了納米鎳暴露對(duì)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物(海鞘類(lèi))精子質(zhì)量的影響。研究結(jié)果提示，納米鎳誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA片段化并改變線(xiàn)粒體膜電位和精子形態(tài)。研究顯示[1-5]，納米鎳能改變細(xì)胞周期、升高ROS水平、損傷DNA和改變某些細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致一系列毒性。我們前期研究還顯示納米鎳可通過(guò)誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡產(chǎn)生生殖損害，并且Caspase通路在其中發(fā)揮著重要作用[12]。本次研究表明納米鎳可以導(dǎo)致大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡，凋亡可能是納米鎳引起細(xì)胞毒性的關(guān)鍵機(jī)制，lncRNA和生殖發(fā)育及細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，但lncRNA在環(huán)境污染物所致生殖損傷中的作用及其機(jī)制研究報(bào)道極少。因此，本研究在基因芯片的檢測(cè)基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，本課題組將結(jié)合生物信息學(xué)分析進(jìn)一步篩選凋亡相關(guān)lncRNA，后期準(zhǔn)備深入研究納米鎳引起的生殖細(xì)胞凋亡過(guò)程中的分子機(jī)制及l(fā)ncRNA在其中的調(diào)控作用，不僅可以明確納米材料生殖毒性的分子機(jī)制，更重要的是為生殖損傷的預(yù)防和治療提供生物標(biāo)志和治療靶標(biāo)，對(duì)保護(hù)生殖健康以及制定納米鎳安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有著極其重要的科學(xué)和實(shí)際意義。

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