450 nm藍(lán)激光靜態(tài)作用于豬膀胱壁組織的生物效應(yīng)

劉國雄，徐曉峰，姜大力，王新陽，喬西民 ，賀大林，吳開杰

(1 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061；2 咸陽市中心醫(yī)院泌尿外科，陜西咸陽 712000)

隨著醫(yī)學(xué)激光技術(shù)的不斷成熟以及醫(yī)療器械的更新?lián)Q代，激光在各個學(xué)科中的應(yīng)用日漸增多，并且逐漸獲得了良好的治療效果[1]。450 nm新型半導(dǎo)體藍(lán)激光(下文中簡稱藍(lán)激光)是自主研發(fā)的世界首創(chuàng)國產(chǎn)藍(lán)激光手術(shù)設(shè)備，由于對血紅蛋白對450 nm藍(lán)激光能量有著更高效的吸收效率，因此該設(shè)備在汽化效率、熱損傷范圍、降耗降噪等各方面獨具優(yōu)勢。300 nm藍(lán)激光設(shè)備已獲得批準(zhǔn)，應(yīng)用于包括膀胱腫瘤在內(nèi)的腔道淺表病變切除手術(shù)[2-3]。

但藍(lán)激光對不同組織的生物學(xué)效應(yīng)可能不同，包括汽化切割和凝固止血效能，特別是在不同治療模式(動態(tài)移動、靜態(tài)作用)下存在差異，未來可能影響其在外科手術(shù)中的具體應(yīng)用。因此，積極在動物實驗及離體活組織中測試不同治療模式和參數(shù)，進(jìn)一步研究藍(lán)激光對各臟器、組織的生物效應(yīng)，探索最佳的、安全的治療參數(shù)，包括作用功率、作用距離及作用時間，可能為其在臨床上膀胱腫瘤手術(shù)中的安全應(yīng)用提供扎實的理論基礎(chǔ)。

本研究選取豬膀胱壁作為實驗對象，旨在模擬藍(lán)激光在膀胱腫瘤手術(shù)中的應(yīng)用場景，著重研究在靜態(tài)作用模式下藍(lán)激光作用方式，探索藍(lán)激光-膀胱組織的生物學(xué)效應(yīng)，為后續(xù)總結(jié)藍(lán)激光在膀胱腫瘤切除術(shù)中精準(zhǔn)切除腫瘤、嚴(yán)密止血應(yīng)用的技巧、避免對正常膀胱壁產(chǎn)生影響打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料西安近郊屠宰廠購買新鮮的豬膀胱組織(實驗當(dāng)天凌晨1～2時取材)，切成約5 cm×7 cm大小，暫存于4 ℃冰箱待用。采用多點測量法測量膀胱組織厚度。藍(lán)激光手術(shù)系統(tǒng)由西安藍(lán)極科技有限公司研制并生產(chǎn)，波長為450 nm，其光纖末端輸出功率為0 ～30 W，功率連續(xù)輸出，可調(diào)節(jié)；光纖直徑800 μm，光纖長度3.0 m。輸出方式：連續(xù)輸出；操作方式：通過腳踏開關(guān)控制激光發(fā)射并持續(xù)時間，通過觸屏調(diào)節(jié)功率、頻率大小。其他實驗儀器有光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，日本)和游標(biāo)卡尺。病理切片、染色由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科完成。

1.2 實驗方法將制備好的膀胱壁組織置于承載盒中，連接光纖與藍(lán)激光手術(shù)系統(tǒng)主機，將光纖安置于步進(jìn)機上(圖1)，開啟激光器，設(shè)置激光參數(shù)。以37 ℃生理鹽水為介質(zhì)，對膀胱組織進(jìn)行定點汽化。

步進(jìn)機可調(diào)整光纖至膀胱組織的距離，組織承載平臺可使膀胱組織處于自然平整狀態(tài)。圖1 步進(jìn)機及組織承載平臺照片

設(shè)置照射時間為1 s，作用功率為5、10、20、30 W，調(diào)試步進(jìn)機使得光纖頭距離膀胱組織分別為0、1、2 mm,結(jié)束后拍攝整體圖，使用游標(biāo)卡尺測量并記錄汽化(凝固)寬度，同時肉眼觀察膀胱黏膜及對側(cè)膀胱漿膜層改變情況。使用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定標(biāo)本，待組織固定好后，使用鋒利刀片對組織進(jìn)行橫向全層切開，觀察同一工作距離、不同工作功率條件下藍(lán)激光的作用效果，并用游標(biāo)卡尺測量并記錄汽化(凝固)深度。進(jìn)行各濃度酒精脫水、不同濃度二甲苯溶液脫酒精、蠟杯浸蠟、包埋等步驟，將包埋好的組織塊送至病理科進(jìn)行切片及蘇木素-尹紅染色，在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察膀胱黏膜損傷的形態(tài)結(jié)構(gòu)，測量汽化寬度、深度及熱損傷范圍。

進(jìn)一步設(shè)置照射時間分別為2、3、5、7、10 s,其余具體操作步驟與前面方法中提到的一致。每一步結(jié)束后做好拍照、測量及記錄，通過肉眼和光學(xué)顯微鏡觀察并記錄不同條件下藍(lán)激光作用膀胱組織所產(chǎn)生的生物效應(yīng)。所有實驗數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次測量，結(jié)果取各測量值的均數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)和圖片處理數(shù)據(jù)處理使用SPSS 18.0軟件，圖片處理使用Photoshop CS5。

2 結(jié) 果

光纖貼近膀胱組織時光斑直徑為0.87 mm；作用距離為1、2 mm的光斑直徑分別為1.26、1.76 mm。不同功率和作用時間及作用距離下，我們觀察到了藍(lán)激光作用于膀胱組織產(chǎn)生的不同效應(yīng)。

2.1 凝固效應(yīng)如圖2、表1所示，450 nm 藍(lán)激光功率為5 W、在照射豬膀胱組織1 s后產(chǎn)生的組織效應(yīng)不明顯，未見明顯的汽化效果和碳化產(chǎn)生；功率為10～30 W、作用時間在1 s時，產(chǎn)生凝固效果。相同功率下作用距離為0～2 mm時，距離越近凝固范圍和深度越大。所產(chǎn)生的凝固寬度0.82～2.83 mm，凝固深度為1.89～3.69 mm。功率5 W及以上、作用時間為2 s及以上時，即刻產(chǎn)生凝固效果，且隨著激光功率增加、照射距離改變，膀胱黏膜表面出現(xiàn)了較為明顯的白色凝固區(qū)域，同一作用距離下隨著功率增加所產(chǎn)生的凝固范圍增大、凝固層厚度增加，雖然膀胱黏膜表明產(chǎn)生凹陷，但未見汽化和碳化發(fā)生。保持激光功率不變，拉近作用距離1～2 mm，凝固范圍和凝固層厚度也隨著增加。

2.2 汽化效應(yīng)與擊穿如圖3、表2所示，當(dāng)功率為5 W，延長作用時間至5 s時，膀胱組織出現(xiàn)了汽化效應(yīng)。隨著作用時間的延長，汽化寬度和深度逐漸增加，但汽化效應(yīng)和作用距離成負(fù)相關(guān)。整體分析得出激光光纖頭貼緊組織進(jìn)行汽化時汽化深度最大，而增加作用距離，作用深度減小、但寬度增加，汽化深度、寬度隨作用時間、距離變化范圍分別是1.3～8.85 mm(穿孔)和1.1～2.56 mm。在作用時間為5、7、10 s時，作用功率為20、30 W時，膀胱組織被擊穿。此外，在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，在功率為30 W、作用距離為3 mm時，連續(xù)作用時間在5、7、10 s時，光纖會發(fā)生爆破聲。

2.3 熱損傷通過光學(xué)顯微鏡觀察，450 nm藍(lán)激光在膀胱組織汽化過程中產(chǎn)生了很小的熱損傷范圍。如圖3A、B所示。在激光功率30 W、作用時間2 s和作用距離2 mm時，除汽化邊緣黏膜產(chǎn)生范圍約1 mm的凝固變性，其黏膜下層、肌肉層無明顯凝固變性；圖3B中膀胱組織被全層擊穿，但在膀胱組織被汽化的邊緣亦無明顯的組織凝固變性現(xiàn)象。

2.4 病理圖4顯示了450 nm藍(lán)激光對膀胱的生物效應(yīng)的病理表現(xiàn)。

A、B、C、D、E、F：依次對應(yīng)作用時間1、2、3、5、7、10 s；每幅小圖激光作用點從左至右功率依次為5、10、20、30 W，由上至下作用距離分別為0、1、2 mm。圖2 450 nm藍(lán)激光對膀胱壁的生物效應(yīng)大體圖

表1 作用時間為1 s時，不同作用距離下5～30 W 450 nm 藍(lán)激光對豬膀胱組織產(chǎn)生凝固效應(yīng) (/mm)

A、B、C、D:依次對應(yīng)作用時間2、3、5、7 s；每幅小圖激光作用點從左至右功率依次為5、10、20、30 W。圖3 作用距離2 mm 時450 nm藍(lán)激光對膀胱壁的生物效應(yīng)剖面圖

表2 作用時間為2～10 s時，不同作用距離下功率5～30 W時 450 nm 藍(lán)激光對豬膀胱組織產(chǎn)生汽化效應(yīng)的測量結(jié)果 (/mm)

A：功率30 W，作用距離2 mm，作用時間2 s；B：功率20 W，作用距離0 mm，作用時間5 s；圖中“黑色標(biāo)尺”表示1 000 μm。圖4 450 nm藍(lán)激光對膀胱壁的生物效應(yīng)病理(HE,×20)

3 討 論

激光組織作用效應(yīng)與激光的波長、發(fā)射的模式(脈沖/連續(xù))、功率、作用距離以及時間等有關(guān)。一項在腎臟組織的研究表明脈沖Tm∶YAG激光器比CW Tm∶YAG激光器產(chǎn)生的碳化更少，比Ho∶YAG激光器造成的創(chuàng)傷更小[4]。就穿透深度和凝固厚度而言，Nd∶YAG激光>綠光激>鈥激光[5]。這主要與近紅外波長激光以水吸收為主、可見波長激光以血紅蛋白吸收為主有關(guān)。關(guān)于藍(lán)激光-組織作用的生物學(xué)效應(yīng)文獻(xiàn)資料報道甚少，LINDEN等[6]于2016年報道了使用3 W藍(lán)激光汽化組織的離體實驗，在作用時間為1 s時，產(chǎn)生了寬約0.8 mm、深度約1.2 mm的長橢圓形組織缺損，汽化周圍凝固層厚度約0.5 mm。另外，BRAUN等[7]于2017發(fā)表的研究顯示使用波長為445 nm半導(dǎo)體藍(lán)激光在豬下頜軟組織進(jìn)行移動汽化切割，汽化功率為2 W，作用距離為1 mm，光纖直徑為320 μm，產(chǎn)生的汽化深度中位數(shù)為0.44 mm。GOBBO等[8]應(yīng)用二極管藍(lán)激光同近紅外波長的二極管激光以及手術(shù)刀，進(jìn)行了口腔黏膜增生病變切割治療的對比研究，其中激光波長為445 nm、功率為2 W、光纖直徑為320 μm，研究結(jié)果表明藍(lán)激光熱損傷范圍為27.2～268.7 μm，而近紅外光熱損傷范圍可達(dá)50.0～406.9 μm。

基于本研究團(tuán)隊前期自主研發(fā)的世界首創(chuàng)國產(chǎn)450 nm新型半導(dǎo)體藍(lán)激光手術(shù)設(shè)備已獲得批準(zhǔn)，應(yīng)用于包括膀胱腫瘤在內(nèi)的腔道淺表病變切除手術(shù)，有必要了解在運動或靜息狀態(tài)下新型450 nm藍(lán)激光在對膀胱病損進(jìn)行手術(shù)時的安全性探索，即進(jìn)一步通過在動物實驗及離體活組織中測試不同治療模式下藍(lán)激光對膀胱壁組織的生物效應(yīng)，以及最佳治療參數(shù)。本研究采用靜態(tài)汽化凝固模式下，在不同功率、照射時間和照射距離情況下，激光對膀胱組織的作用效果。一般情況下，凝固效應(yīng)利于手術(shù)止血，建議在進(jìn)行手術(shù)時，降低功率，根據(jù)需要調(diào)節(jié)光纖頭至組織的距離，這樣才能有效止血和最大程度地避免組織損傷。建議凝固止血時將功率調(diào)至10～ 15 W，并采用單踩腳踏進(jìn)行止血，踩下腳踏時間建議1～2 s。

汽化效應(yīng)有利于對目標(biāo)組織進(jìn)行切割，根據(jù)實驗結(jié)果，本研究建議在對膀胱組織進(jìn)行汽化切割時，為確保安全，務(wù)必要對目標(biāo)點位進(jìn)行有距離操作，且避免腳踏踩踏時間過長。建議汽化膀胱組織時可調(diào)節(jié)功率至20～30 W，作用距離調(diào)整至1～2 mm，腳踏踩下時間避免超過3 s，汽化切割過程中不可反復(fù)對同一位置進(jìn)行激光照射，嚴(yán)防膀胱穿孔。

本研究首次采用靜態(tài)作用模式下評估新型450 nm藍(lán)激光對豬膀胱組織的生物學(xué)效應(yīng)，包括凝固效應(yīng)和汽化效應(yīng)，初步得出了在靜態(tài)作用模式下，藍(lán)激光的安全范圍，包括激光功率范圍、照射時間以及照射距離等作用參數(shù)，這可為國產(chǎn)創(chuàng)新藍(lán)激光在治療包括膀胱腫瘤等膀胱腔內(nèi)病變的推廣應(yīng)用提供扎實的理論基礎(chǔ)。