miR-208b-3p在右美托咪定減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用研究*

楊馮睿，易 漢，汪 超，楊 歡，胡嘯玲

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南衡陽 421001)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)在心肺復(fù)蘇、心肌梗死溶栓、介入治療及心臟移植中時(shí)有發(fā)生，由此引發(fā)的心律失常、心力衰竭和再梗死等并發(fā)癥不僅影響了治療效果，也給患者生命造成了嚴(yán)重威脅[1]。因此探索防治MIRI的藥物及靶點(diǎn)具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)具有改善缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion,I/R)損傷的作用[2-3]，但具體機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可通過下調(diào)miR-208b-3p水平來抑制大鼠的MIRI，而過表達(dá) miR-208b-3p水平可加重MIRI癥狀，提示miR-208b-3p在MIRI發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用[4]。本研究擬觀察miR-208b-3p是否影響DEX對(duì)MIRI的改善作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 DEX購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，miR-208b-3p模擬物(miR-208b-3p mimics，miRNA mimics是針對(duì)miRNA的成熟體設(shè)計(jì)并合成的小片段雙鏈miRNA，作用與miRNA的成熟體一樣，可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)miRNA的含量)購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司，肌鈣蛋白(cTn-Ⅰ)、肌酸激酶(CK-MB)檢測試劑盒購自碧云天生物科技公司，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司，Bax、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)和Bcl-2一抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

表1 各組大鼠的心功能指標(biāo)比較

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與DEX組比較

1.2.1分組 將成年雄性Wister大鼠(體質(zhì)量為280～320 g)80只分為假手術(shù)(Sham)組、I/R組、DEX組和miR-208b-3p+DEX組(n=20)。Sham組：冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線，不結(jié)扎；I/R組：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支45 min，再灌注120 min，再灌注前10 min由股靜脈緩慢注入生理鹽水(1 mL/100 g)；DEX組在I/R前經(jīng)股靜脈注射5 μg/kg負(fù)荷劑量的DEX，然后以5 μg·kg-1·h-1持續(xù)輸注1 h，miR-208b-3p+DEX組在I/R前24 h心肌內(nèi)注射miR-208b-3p模擬物(miR-208b-3p mimics，1×103mol/L)，DEX用法同DEX組。本實(shí)驗(yàn)所用大鼠均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于無特定病原體(SPF)級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，濕度控制在60%～70%，室溫為(22±1)℃，照明晝夜明暗交替時(shí)間為12 h∶12 h。

1.2.2血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測定 I/R 120 min后經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管至左心室，連接至八導(dǎo)生理記錄儀，記錄心率(heart rate，HR)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左心室變化速率最大值(±dp/dtmax)。

1.2.3血清CK-MB和cTn-Ⅰ水平測定 I/R 120 min后收集右頸總動(dòng)脈血4 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，分離出血清，分別用全自動(dòng)生化分析儀和ELISA法測血清CK-MB活性和cTn-Ⅰ水平。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4心肌凋亡細(xì)胞原位測定 嚴(yán)格按照TUNEL凋亡測試試劑盒說明書操作。光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，棕色為TUNEL 染色陽性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野(×400倍)，計(jì)數(shù)凋亡陽性細(xì)胞，以凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/所有細(xì)胞個(gè)數(shù)作為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，AI反映各組心肌細(xì)胞凋亡的情況。

1.2.5心肌氧化相關(guān)指標(biāo)檢測 I/R 120 min 后取大鼠左心室結(jié)扎線以下心尖部缺血區(qū)心肌組織，每20 mg組織加入150 μL裂解液，與生理鹽水混合后研磨勻漿，4 ℃ 15 000 r/min離心5 min，取上清液；硫代巴比妥酸法測定MDA水平，試劑盒法檢測谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。

1.2.6心肌凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 I/R 120 min 后取大鼠左心室結(jié)扎線以下心尖部缺血區(qū)心肌組織，于液氮中迅速冷凍后研磨，制備勻漿后檢測蛋白含量，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉后，給予Bax、Bcl-2和半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)的一抗孵育，TBST洗膜后孵育二抗，經(jīng)曝光顯影后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最終結(jié)果表示為目的蛋白與內(nèi)參光密度的比值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠的心功能指標(biāo)比較 與Sham組比較，I/R組LVSP、-dp/dtmax和+dp/dtmax降低，LVEDP升高(P<0.05)；與I/R組比較，DEX組的LVSP、-dp/dtmax和+dp/dtmax均升高，LVEDP降低(P<0.05)；miR-208b-3p mimics可降低DEX對(duì)I/R大鼠心功能的改善效果，見表1。

2.2各組大鼠血清cTn-Ⅰ、CK-MB水平及AI比較 與Sham組比較，I/R組的cTn-Ⅰ、CK-MB水平及AI均升高(P<0.05)；與I/R組比較，DEX組的cTn-Ⅰ、CK-MB水平及AI均降低(P<0.05)；與DEX組比較，miR-208b-3p+DEX組cTn-Ⅰ、CK-MB水平及AI均升高，見表2。

表2 各組大鼠血清 cTn-Ⅰ、CK-MB水平及AI比較

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與DEX組比較

2.3各組大鼠心肌組織中的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較 與Sham組比較，I/R組的GSH-Px、T-AOC及SOD活性均降低，MDA水平升高(P<0.05)；與I/R組比較，DEX組的GSH-Px、T-AOC及SOD活性均升高，MDA水平降低(P<0.05)；miR-208b-3p mimics可降低DEX對(duì)I/R大鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的改善效果，見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與DEX組比較

2.4各組大鼠肌凋亡相關(guān)基因表達(dá)的比較 與Sham組比較，I/R組的Bax、Caspase-3水平均升高，Bcl-2水平降低(P<0.05)；與I/R組比較，DEX組的Bax、Caspase-3水平均降低，Bcl-2水平升高(P<0.05)；miR-208b-3p mimics可降低DEX對(duì)I/R大鼠心肌Bax、Caspase-3和Bcl-2的改善效果。見表4。

表4 各組大鼠心肌凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與DEX組比較

3 討 論

MIRI是指在心肌缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)功能破壞反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象[5]。近年來，MIRI的發(fā)生機(jī)制已得到深入研究。目前公認(rèn)的是細(xì)胞凋亡與MIRI及I/R過程密切相關(guān)[6]。大量證據(jù)顯示，在許多器官和組織中抗凋亡的調(diào)節(jié)與許多基因的調(diào)節(jié)有關(guān)，包括Bcl-2家族、Caspase家族、p53和核因子-κB。心肌細(xì)胞的凋亡是MIRI的關(guān)鍵細(xì)胞事件[7-8]，越來越多的研究都集中在如何減輕心肌細(xì)胞凋亡。

多項(xiàng)研究的結(jié)果表明，給予DEX處理對(duì)發(fā)生I/R損傷的心肌細(xì)胞有較好的保護(hù)作用。秦智剛等[9]發(fā)現(xiàn)DEX能在一定程度上減輕體外循環(huán)下的MIRI，其機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。吳志林等[10]發(fā)現(xiàn)DEX定可通過抗氧化應(yīng)激，降低炎性反應(yīng)而減輕大鼠MIRI。但DEX改善MIRI的機(jī)制目前尚不清楚。

microRNAs對(duì)發(fā)生IRI心肌細(xì)胞的凋亡有較好的調(diào)控作用。其中miR-208b-3p具有促凋亡作用[4]，且研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)其水平可減輕IRI。本研究發(fā)現(xiàn)I/R組出現(xiàn)心功能異常，而給予DEX處理后以上指標(biāo)獲改善，以上結(jié)果表明I/R模型制備成功，且DEX具有較好的心肌I/R損傷保護(hù)作用。

本研究進(jìn)一步采用過表達(dá)miR-208b-3p發(fā)現(xiàn)DEX對(duì)MIRI的改善效果被逆轉(zhuǎn)，表明DEX可通過下調(diào)miR-208b-3p水平來發(fā)揮對(duì)MIRI的保護(hù)作用。miR-208b-3p是一種促凋亡蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-208b-3p處理后導(dǎo)致Bax和Caspase-3水平升高，Bcl-2水平降低，提示miR-208b-3p可能通過促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)來逆轉(zhuǎn)DEX對(duì)MIRI的改善效果。多項(xiàng)研究指出氧化應(yīng)激也是導(dǎo)致MIRI的原因之一[11-12]，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-208b-3p后可導(dǎo)致GSH-Px、T-AOC及SOD活性均降低，MDA水平升高，表明miR-208b-3p可影響DEX對(duì)氧化應(yīng)激的改善效果。

綜上所述，過表達(dá)miR-208b-3p可消除DEX對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用，提示miR-208b-3p可能參與了I/R損傷的發(fā)生、發(fā)展。

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