肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展*

何文杰，王羽豐，李 佳，李繼鵬 綜述，江 波審校

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院干部醫(yī)療科 650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院急診內(nèi)科 650031)

每一年全球新發(fā)肺癌患者160萬(wàn)人，因肺癌死亡患者140萬(wàn)人[1]。多數(shù)肺癌患者就診時(shí)已為晚期，常伴發(fā)有一個(gè)甚至多個(gè)器官的轉(zhuǎn)移。90%肺癌患者并非死于原發(fā)腫瘤，而是因轉(zhuǎn)移灶引起器官衰竭而死亡[2]。當(dāng)前，無(wú)論是影像學(xué)還是血清腫瘤標(biāo)志物都難以及時(shí)而精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展。因此，建立一種精準(zhǔn)、便捷、能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的診斷方法，成為全球肺癌研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

19世紀(jì)末期，PAGET提出了腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子與土壤”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為攜帶腫瘤細(xì)胞的種子能夠從原發(fā)腫瘤脫落轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官的土壤中繼續(xù)生存。依據(jù)這一學(xué)說(shuō)，提出了循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念，即由原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤脫落后進(jìn)入到循環(huán)血液中，具有腫瘤基因特征或腫瘤抗原特性的惡性腫瘤細(xì)胞[3]。當(dāng)前的研究顯示，在發(fā)生轉(zhuǎn)移之前，惡性腫瘤細(xì)胞就可釋放CTCs通過(guò)上皮細(xì)胞間充質(zhì)化進(jìn)入轉(zhuǎn)移器官中[4]。CTCs可作為肺癌早期診斷、評(píng)價(jià)療效及預(yù)后、檢測(cè)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)，也可檢測(cè)肺癌驅(qū)動(dòng)基因的突變狀態(tài)，指導(dǎo)肺癌的靶向治療。但CTCs檢測(cè)的精確性、科學(xué)性在學(xué)術(shù)界仍存在爭(zhēng)議，仍需進(jìn)一步的研究和探索。

本文主要總結(jié)了當(dāng)前CTCs的檢測(cè)方法及在肺癌中應(yīng)用的現(xiàn)狀及前景及CTCs的特性與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性問(wèn)題。同時(shí)也突顯出了當(dāng)前CTCs在肺癌診斷、治療中得到廣泛臨床認(rèn)可及推廣需要解決的問(wèn)題。

1 CTCs的檢測(cè)方法

當(dāng)前CTCs檢測(cè)技術(shù)主要分為富集技術(shù)和分析技術(shù)兩大方面。

1.1富集技術(shù)

1.1.1基于形態(tài)學(xué)的分離法 基于腫瘤細(xì)胞與正常血細(xì)胞相比，有更大的體積(>8 μm)、不同的密度及形態(tài)的原理，建立了基于CTCs形態(tài)學(xué)的分離法。包括基于腫瘤細(xì)胞大小的分離法(isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)和密度梯度法。

首先建立的是ISET法，其通過(guò)一定孔徑的聚碳酸酯膜設(shè)計(jì)腫瘤分子屏障，依據(jù)腫瘤細(xì)胞較正常血細(xì)胞直徑大的原理分離CTCs。通過(guò)物理特性的原理分離出的CTCs形態(tài)完整，細(xì)胞的特性得以完整保存，其表達(dá)的抗原未遭破壞，提高了后續(xù)免疫標(biāo)記、染色等的可行性和準(zhǔn)確性。但外周血中的也存在著許多大分子的細(xì)胞，同時(shí)部分CTCs體積較血細(xì)胞相似甚至更小，從而降低了該檢測(cè)方法的靈敏度和特異度。

密度梯度法依據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常血細(xì)胞不同的密度差，通過(guò)離心的方式將血液分層為血清、白細(xì)胞、CTCs和單核細(xì)胞、紅細(xì)胞等。該方法操作簡(jiǎn)便、易行，對(duì)設(shè)備、試劑要求較低，但離心過(guò)程中容易使CTCs與單核細(xì)胞混入血漿層或積聚成團(tuán)混入紅細(xì)胞層。有鑒于此，改進(jìn)后的Oncoquick法，通過(guò)放置多孔膜在分離液與血液之間，防止交叉混合，從而降低CTCs的損失率。而RosetteSepTM法，通過(guò)抗體交聯(lián)的方式與不需要的血細(xì)胞交聯(lián)，增加其密度，離心后使其沉降到最底層，從而容易被去除。該方法能夠極大提高CTCs的富集率。

1.1.2免疫磁性分離法 免疫磁性分離法是當(dāng)前認(rèn)可度最高的CTCs富集方法。其工作原理為上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞一般都表達(dá)上皮黏附分子(EpCAM)和細(xì)胞角蛋白(CK)，而這些分子在血細(xì)胞中是不表達(dá)的。同時(shí)，一些腫瘤具有特異性的腫瘤標(biāo)志物，例如Her2-neu、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)等。將這些特異性的分子抗體與免疫磁珠結(jié)合，形成陽(yáng)性免疫磁珠，與腫瘤細(xì)胞特異性抗原相結(jié)合，通過(guò)磁場(chǎng)的作用被吸附出來(lái)。另外，將含有特異性白細(xì)胞表面抗體如CD45抗體與免疫磁珠結(jié)合，形成陰性免疫磁珠，消除血細(xì)胞中的白細(xì)胞,有利于之后針對(duì)CTCs的免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光分析檢測(cè)[5]。但在循環(huán)系統(tǒng)中，上皮特異性抗體可標(biāo)記非腫瘤性的上皮細(xì)胞，從而增加了假陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)，免疫磁性檢測(cè)方法，對(duì)檢測(cè)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)條件要求較高，檢測(cè)步驟繁瑣，費(fèi)用昂貴，這也限制了其在臨床工作中的推廣和應(yīng)用。

1.2分析技術(shù)

1.2.1基于免疫細(xì)胞化學(xué)的分析技術(shù) 免疫細(xì)胞化學(xué)法是將待檢測(cè)的細(xì)胞固定后，與帶有熒光的上皮性腫瘤細(xì)胞特異性抗原如EpCAM、CK的抗體結(jié)合，依據(jù)抗原抗體的反應(yīng)，檢測(cè)CTCs的存在及數(shù)量。同時(shí)，加入特殊的抗白細(xì)胞抗體來(lái)排除假陽(yáng)性的發(fā)生。當(dāng)前常用的檢測(cè)方法有流式細(xì)胞技術(shù)、光纖陣列掃描技術(shù)(fiber-optic array scanning technology,FAST)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)(enzyme-linked epithelial immunospot assay,EPISPOT)。

流式細(xì)胞術(shù)是一種利用識(shí)別熒光染色的單克隆抗體標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞,來(lái)分析和檢測(cè)富集后分離的CTCs的技術(shù)。其具有高效、快速、精確的特性。此外，流式細(xì)胞術(shù)還能夠同期對(duì)CTCs進(jìn)行細(xì)胞大小、形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)外標(biāo)記物、DNA特性等多參數(shù)分析[6]。

FAST是一種更為高效、快速的流式細(xì)胞技術(shù)。通過(guò)配備一個(gè)50 341 mm的分析視野，其掃描、分析熒光標(biāo)記的CTCs的速率是常規(guī)檢測(cè)方法的500倍。MARRINUCCI等[7]研究顯示，在晚期大腸癌患者中，F(xiàn)AST與傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)、反轉(zhuǎn)錄PCR比較，能夠更為快速地發(fā)現(xiàn)更多數(shù)量的CTCs。目前該方法多用于小樣本量臨床試驗(yàn)階段。

EPISPO首先利用免疫陽(yáng)性磁珠分離出帶有腫瘤特異性抗原的細(xì)胞，利用免疫陰性磁珠去除血液中的白細(xì)胞。之后與帶有熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合，利用熒光檢測(cè)方法分析分泌腫瘤特異性蛋白的CTCs[8]。

1.2.2基于核酸的分析技術(shù) 反轉(zhuǎn)錄PCR是目前廣泛用于肺癌CTCs分析的技術(shù)之一，其主要通過(guò)檢測(cè)外周血中表達(dá)腫瘤相關(guān)標(biāo)記物的mRNA(CEA mRNA,CK19 mRNA,LUNX mRNA等)碎片，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄的方式轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，再利用PCR技術(shù)擴(kuò)增后檢測(cè)、分析CTCs[9]。

CellSearchTM系統(tǒng)目前在肺癌CTCs檢測(cè)中得到廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用。該系統(tǒng)主要由自動(dòng)化的免疫磁性分離系統(tǒng)和免疫熒光分析系統(tǒng)組成。檢測(cè)標(biāo)本首先通過(guò)陽(yáng)性和陰性免疫磁珠，分離出EpCAM+CK+的細(xì)胞，去除CD45+的白細(xì)胞。再通過(guò)包含有備選檢測(cè)圖像的圖庫(kù)，對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行全自動(dòng)的熒光分析，最終篩選出直徑大、細(xì)胞變形、細(xì)胞核變異、染色異常的CK+EpCAM+CD45-細(xì)胞為CTCs[10]。該系統(tǒng)具有高效、快捷、操作簡(jiǎn)便、靈敏度及特異度高的特點(diǎn)。但該系統(tǒng)也存在部分不表達(dá)腫瘤特異性抗原的CTCs無(wú)法被檢出的缺陷。

CTCs-chip通過(guò)7 800個(gè)結(jié)合抗EpCAM抗體的微陣列組成微流體平臺(tái)，嚴(yán)格控制血液流過(guò)芯片的速度和剪切力，每1個(gè)位點(diǎn)能夠直接捕獲CK+、EpCAM+、DAPI+的CTCs，而CD45+的血細(xì)胞則被消除。在肺癌、乳腺癌、腸癌、前列腺癌、胰腺癌中可達(dá)到99.1%的靈敏度和100.0%的特異度[11]。該方法僅需一步操作，不需要復(fù)雜的前期準(zhǔn)備，能夠最大化地避免CTCs的丟失、破壞及標(biāo)本的污染。同時(shí)，該方法還能檢測(cè)出既往檢測(cè)方法沒(méi)有發(fā)現(xiàn)過(guò)的罕見(jiàn)CTCs細(xì)胞群。

2 CTCs在早期肺癌診斷中的預(yù)測(cè)價(jià)值

在肺癌早期階段，CTCs的存在并不直接意味遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的存在。只有極少的CTCs能夠與血管內(nèi)皮建立聯(lián)系，通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的形式侵入遠(yuǎn)處薄壁組織，形成轉(zhuǎn)移瘤[12]。TANAKA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，30.6%的早期肺癌患者能檢測(cè)到CTCs。而分期越晚，CTCs檢出率越高。KURUSU等[14]研究顯示在ⅡA、ⅡB、ⅢA期肺癌患者中CTCs檢出率為50%、73%、100%，高于ⅠA、ⅠB期的36%、41%。

3 CTCs在肺癌手術(shù)中的預(yù)測(cè)價(jià)值

SAWABATA等[15]發(fā)現(xiàn)術(shù)后每7.5 mL血液中CTCs≥5個(gè)有更短的腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間。YAMASHITA等[16]發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTCs的數(shù)量與總生存率相關(guān)。提示CTCs可做為檢測(cè)術(shù)中腫瘤播散、預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的有效指標(biāo)。對(duì)術(shù)后CTCs高于分界點(diǎn)的患者，即使為ⅠA或ⅠB期，術(shù)后輔助化療是否盡早使用仍值得進(jìn)一步研究。

4 CTCs在進(jìn)展期肺癌診斷中的價(jià)值

KATSEL等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CK19陽(yáng)性的CTCs與淋巴結(jié)、骨、腎上腺、腦轉(zhuǎn)移相關(guān)；PTHrP陽(yáng)性的CTCs與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)；LUNX陽(yáng)性的CTCs與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Ⅳ期肺癌患者的CTCs檢出率明顯增高。MUINELO等[18]研究顯示，CTCs是影響進(jìn)展期NSCLC患者化療后無(wú)瘤生存率及總體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。雖然多數(shù)研究都支持CTCs可作為進(jìn)展期肺癌診斷、評(píng)價(jià)療效及預(yù)后的指標(biāo)，但仍存在檢出率差異大，結(jié)果對(duì)立等問(wèn)題。這可能與檢測(cè)方法及治療模式不統(tǒng)一，療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不一致、敏感性不足、樣本量偏小等因素有關(guān)。仍需高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)的發(fā)展、統(tǒng)一，開(kāi)展多中心、大樣本量的研究來(lái)解決。

5 CTCs在進(jìn)展期肺癌化療應(yīng)用的價(jià)值

NAGRATH等[19]研究發(fā)現(xiàn)，每一周期化療后CTCs檢出值的變化與腫瘤體積的變化一致，CTCs檢出率越低的患者，療效越好。但NAIR等[20]研究發(fā)現(xiàn)，CTCs的變化與化療后腫瘤體積的變化沒(méi)有相關(guān)性。這些研究結(jié)果的不一致性，可能與腫瘤的異質(zhì)性、化療方案的差異、耐藥基因的表達(dá)不同等因素有關(guān)，值得我們進(jìn)一步的探索和研究。

6 CTCs在肺癌放療應(yīng)用的價(jià)值

CHEN等[21]研究顯示，接受同期放化療后，未檢出CTCs的肺癌患者其療效及預(yù)后明顯優(yōu)于檢出CTCs的患者。但GE等[22]研究顯示，根治性放療后的肺癌患者，雖然CTCs檢出值有明顯的降低，但與療效沒(méi)有相關(guān)性。

7 CTCs在肺癌分子靶向治療應(yīng)用的價(jià)值

CTCs由于具有原發(fā)腫瘤同源的基因及遺傳特性，因此能微創(chuàng)、動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)的檢測(cè)肺癌驅(qū)動(dòng)基因，在臨床上已開(kāi)始得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。

當(dāng)前研究顯示，通過(guò)CTCs檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)突變與組織檢測(cè)EGFR突變具有高度的一致性，同時(shí)通過(guò)CTCs檢測(cè)T790M的突變能夠預(yù)測(cè)耐藥性的發(fā)生。MAHESWARAN等[23]通過(guò)CTCs檢測(cè)并經(jīng)組織證實(shí)具有EGFR突變的患者，其一致性達(dá)95%；而在64%耐藥后的患者中，有33%檢測(cè)到T790M的突變。SUNDARESAN等[24]研究發(fā)現(xiàn)，組織中與CTCs中T790M突變檢出率分別為75%和70%。PAILLER等[25]分別檢測(cè)組織與CTCs中的間變淋巴瘤激酶(ALK)重排發(fā)現(xiàn)，檢出ALK重排一致性100%。

目前通過(guò)CTCs檢測(cè)肺癌患者的驅(qū)動(dòng)基因仍存在特異度高而靈敏度低的缺點(diǎn)。對(duì)CTCs檢測(cè)基因陰性的患者仍需組織基因檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)。因此，提高檢測(cè)技術(shù)的靈敏度仍是CTCs能否在基因檢測(cè)領(lǐng)域得到進(jìn)一步推廣和應(yīng)用的關(guān)鍵所在。

8 CTCs的發(fā)展展望

近幾年來(lái)，CTCs在整個(gè)腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了極大的關(guān)注。首先，CTCs具有安全、方便、實(shí)時(shí)、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，在肺癌的篩查、診斷、治療、預(yù)后等方面具有較好的應(yīng)用前景。其次，通過(guò)CTCs檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因的突變，可作為靶向藥物選擇的依據(jù)。再次，通過(guò)研究CTCs的分子和基因特征，能夠深入了解肺癌的生物學(xué)特性及轉(zhuǎn)移機(jī)制。

但目前存在的許多問(wèn)題仍限制CTCs在臨床中廣泛應(yīng)用，主要包括(1)由于肺癌缺乏特異度的腫瘤標(biāo)志物，而循環(huán)系統(tǒng)中CTCs數(shù)量稀少，現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)均存在特異度高，而靈敏度不足的缺點(diǎn);(2)當(dāng)前與CTCs相關(guān)的臨床研究，由于在試驗(yàn)設(shè)計(jì)、方法、對(duì)象、標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控等方面的不同，其結(jié)果存在較大的差異性和矛盾性。缺乏多中心、大樣本量的試驗(yàn)研究來(lái)建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和共識(shí);(3)當(dāng)前CTCs檢測(cè)費(fèi)用昂貴，無(wú)法作為臨床常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)一步推廣。

目前CTCs仍無(wú)法取代組織病理在肺癌中“金標(biāo)準(zhǔn)”的地位，但隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷更新和發(fā)展，其在肺癌研究、預(yù)防、診斷、治療領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)將會(huì)突顯，從而得到推廣和應(yīng)用。

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