清金顆粒對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染肺炎模型小鼠的影響

張少言+張曄敏+吳定中+馬子風(fēng)+錢家驊+張惠勇+鹿振輝

摘要：目的 觀察清金顆粒對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）肺炎模型小鼠的干預(yù)效應(yīng)。方法 采用菌液滴鼻法制作肺炎小鼠模型。將實驗小鼠隨機分為空白組、模型組、西藥組和中藥組，造模后第3日開始給藥，西藥組給予利奈唑胺灌胃，中藥組給予清金顆粒灌胃，空白組和模型組給予生理鹽水灌胃。造模后每日觀察小鼠體質(zhì)量變化及臨床表現(xiàn)，第3、10日CT檢測肺部影像學(xué)變化，HE染色觀察肺組織病理變化，檢測肺部載菌量。結(jié)果 造模組小鼠感染后第1日體質(zhì)量顯著下降，感染后第3日肺部CT示兩肺充滿炎性滲出物；給藥后第7日中藥組較模型組小鼠肺部炎癥明顯減輕，炎性滲出物減少，僅有散在炎性滲出物，同時肺部炎性病理表現(xiàn)減輕，且肺部載菌量明顯降低（P<0.05），但較西藥組效果稍差（P<0.05）。結(jié)論 清金顆粒能夠顯著降低小鼠肺部載菌量，減少肺組織炎細(xì)胞浸潤，對MRSA感染肺炎小鼠有治療作用。

關(guān)鍵詞：清金顆粒；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；肺炎；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.013

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）02-0055-04

Effects of Qingjin Granules on Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus Pneumonia Mice

ZHANG Shao-yan， ZHANG Ye-min， WU Ding-zhong， MA Zi-feng，

QIAN Jia-hua， ZHANG Hui-yong， LU Zhen-hui

Longhua Hospital Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200032， China

Abstract： Objective To observe the effects of Qingjin Granules on methicillin-resistant staphylococcus aureus （MRSA） pneumonia mice. Methods Pneumonia model was prepared by intranasal drip of bacterial fluid. Experimental mice were randomly divided into control group， model group， Western medicine group and TCM group. On the third day after infection， the Western medicine group was treated with linezolid， and the TCM group was given Qingjin Granules for gavage. The control and model group were given the same amount of normal saline for gavage. Body weight and clinical manifestations every day of each mouse after infected were recorded. Lung scans at day 3 and day 10 were taken； the pathological changes trough HE staining were observed； microbial load of lung tissue was detected. Results There were significant weight losses on mice except control group on the first day after infection. CT scan showed that the lung inflammation was filled with mice on the third day after infection. The lung inflammation in the TCM group was more reduced than model group， with less inflammatory exudate and only scattered inflammatory exudates. Meanwhile， pulmonary inflammatory pathology was reduced and the amount of bacteria were reduced in the lungs of TCM group （P<0.05）， but it was less effective than linezolid （P<0.05）. Conclusion Qingjin Granules can significantly reduce the microbial load of the lung and infiltration of inflammatory cells in lung tissue of mice， achieving the efficacy of treating MRSA pneumonia in mice.

Keywords： Qingjin Granules； methicillin-resistant staphylococcus aureus； pneumonia； mice

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）是引起醫(yī)院和社區(qū)相關(guān)性感染的重要致病菌之一，2010年我國臨床分離菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示，MRSA菌株的分離率達(dá)到51.7%[1]，在革蘭陽性球菌中占第1位。目前臨床用于治療MRSA的萬古霉素、利奈唑胺和替考拉寧等藥物或不良反應(yīng)顯著，或價格昂貴[2]。有研究顯示，中藥提取物具有明顯的抗MRSA作用[3-4]。清金顆粒是由全國名老中醫(yī)邵長榮教授的芩部丹、三草顆粒、三參顆粒3個復(fù)方組合優(yōu)化而成，具有清熱解毒祛邪、益氣養(yǎng)陰扶正的功效，長期用于多重耐藥菌（MDRO）感染的臨床驗方。本實驗建立MRSA感染性肺炎小鼠模型，采用清金顆粒對MRSA肺炎小鼠進(jìn)行干預(yù)，并通過肺部CT、肺載菌量、肺組織病理變化觀察清金顆粒對MRSA肺炎小鼠的影響，以期為MRSA感染性肺炎的治療提供依據(jù)。endprint

1 實驗材料

1.1 動物

C57BL/6小鼠40只，SPF級，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量（20±5）g，上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于動物生物安全防護(hù)二級實驗室。

1.2 藥物

清金顆粒（黃芩12 g、百部18 g、丹參12 g、魚腥草15 g、夏枯草15 g等），上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房；利奈唑胺片，Pfizer Pharmaceuticals LLC，批號H20130609。中藥煎劑濃度及西藥濃度均根據(jù)成人日服劑量，按體表面積法換算等效劑量。

1.3 主要試劑與儀器

MRSA菌株（ST239型，上海華山醫(yī)院臨床檢驗科），胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（BD-236950），戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，進(jìn)口分裝）。萊卡2135型石蠟切片機（德國萊卡公司），生物顯微鏡（德國萊卡公司），熒光相差正置顯微鏡（日本Nikon公司），臺式恒溫振蕩器（浙江賽德儀器設(shè)備有限公司），小動物活體Micro-CT系統(tǒng)（美國GE公司）。

2 實驗方法

2.1 菌液制備

從瓊脂平板上挑取MRSA菌株，接種于TSA液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩過夜。第2日取50 μL培養(yǎng)菌液重新接種到5 mL新的TSA培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)菌長至對數(shù)期時，將菌液離心去上清，收集細(xì)菌沉淀，用無菌PBS洗滌2次，懸浮細(xì)菌至1.0×109 CFU/mL。

2.2 造模

參考文獻(xiàn)[5]方法制作MRSA感染性肺炎小鼠。除空白組外，其余各組小鼠均從左側(cè)鼻腔滴入50 μL濃度為1.0×109 CFU/mL的MRSA菌液，空白組小鼠從左側(cè)鼻腔滴入50 μL無菌生理鹽水，接種后將小鼠身體直立并維持約1 min以保證菌液充分吸收，連續(xù)觀察3 d。

2.3 分組及藥物干預(yù)

實驗小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，隨機分為空白組、模型組、西藥組和中藥組，每組10只。感染3 d后，西藥組和中藥組小鼠分別給予0.4 mL利奈唑胺和清金顆粒藥液灌胃，空白組和模型組小鼠給予等量生理鹽水灌胃，早晚各1次，連續(xù)7 d。

2.4 觀察及檢測指標(biāo)

2.4.1 一般觀察

觀察小鼠活動和精神狀況、飲水、飲食情況，每日稱量小鼠體質(zhì)量并記錄。

2.4.2 肺部CT掃描

于感染后第3日隨機選取空白組、模型組、西藥組和中藥組小鼠各2只，采用Micro-CT系統(tǒng)進(jìn)行胸部CT掃描，第10日復(fù)查CT。

2.4.3 肺載菌量計數(shù)

感染后第10日，各組隨機選取5只小鼠，處死后立即分離全肺，無菌條件下將全肺研磨成勻漿后在TSA培養(yǎng)基上鋪板，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。

2.4.4 肺組織病理觀察

感染后第10日，將各組剩余5只小鼠麻醉，取全肺，于福爾馬林液室溫固定，脫水后石蠟包埋，切片，HE染色觀察病理變化。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以—x±s表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較用方差分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

模型組小鼠感染后出現(xiàn)精神萎靡不振、毛發(fā)黯淡、反應(yīng)遲鈍、活動量變少，部分小鼠相互蜷成團(tuán)狀，飲水量和進(jìn)食量減少；西藥組和中藥組小鼠感染3 d精神狀態(tài)逐漸恢復(fù)，活動量、進(jìn)食和飲水量有所增加；空白組小鼠在整個實驗過程中活動及飲水飲食均正常，毛發(fā)有光澤，未出現(xiàn)明顯異常。整個實驗過程中各組小鼠均未發(fā)現(xiàn)死亡。MRSA菌液滴鼻后第1日，造模小鼠體質(zhì)量顯著下降。隨感染時間的延長，各組小鼠體質(zhì)量呈逐漸恢復(fù)態(tài)勢。

4.2 肺部CT掃描變化

選取各組同一只小鼠第3、10日CT片中炎癥最重的平面圖對比發(fā)現(xiàn)：感染3 d時，模型組、西藥組和中藥組小鼠雙肺充滿炎性滲出物，提示有病變發(fā)生；空白組小鼠兩肺輪廓和肺門結(jié)構(gòu)清晰可見，氣管和主要支氣管通暢；給藥7 d時，西藥組和中藥組小鼠肺部炎癥較前減輕，炎性滲出物減少，僅有散在炎性滲出物；模型組小鼠肺部表現(xiàn)較之前無明顯變化。

結(jié)果見圖1、圖2。

4.3 肺部載菌量變化

模型組小鼠肺部有大量MRSA，空白組小鼠肺部無MRSA，表明MRSA感染肺炎小鼠模型制作成功。中藥組和西藥組小鼠肺部載菌量較模型組顯著減少（P<0.05），中藥組小鼠肺部載菌量高于西藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。

4.4 肺組織病理變化

空白組小鼠氣管上皮纖毛整齊排列，肺泡腔內(nèi)無炎性分泌物，肺泡結(jié)構(gòu)完好；模型組小鼠肺組織病理改變明顯，支氣管管腔狹窄，充滿炎性滲出物，肺泡壁充血增厚，肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，氣管上皮纖毛脫落，部分纖毛消失；西藥組小鼠肺組織與模型組比較，基本無炎性滲出物，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，炎癥明顯減輕；中藥組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，部分肺泡及間質(zhì)有炎性細(xì)胞分布，與模型組比較炎癥明顯減輕。結(jié)果見圖3。

5 討論

中醫(yī)學(xué)將MRSA感染性肺炎歸屬于“風(fēng)溫肺熱病”范疇，病變部位在肺，其主要病因病機為正氣不足，感受風(fēng)熱毒邪，邪毒內(nèi)伏。清金顆粒主要針對外感熱病氣陰兩虛兼熱毒內(nèi)蘊，長期用于MRSA、耐多藥結(jié)核分枝桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌等MDRO感染的治療，均取得較好療效[6-7]。

本研究CT結(jié)果顯示，清金顆粒組小鼠肺部炎癥較給藥前明顯減輕，炎性滲出物減少，僅有散在炎性滲出物。同時，清金顆粒能明顯降低MRSA感染小鼠肺部的載菌量，但較利奈唑胺的效果差；能明顯減輕MRSA感染小鼠肺部的炎性病理改變。CT結(jié)果與肺部載菌量及肺組織病理HE染色結(jié)果吻合。endprint

清金顆粒治療MRSA感染性肺炎的療效確切，方中黃芩清熱燥濕、瀉火解毒?，F(xiàn)代藥理研究顯示，黃芩中有效成分黃芩苷對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用[8]。百部有潤肺止咳功效；丹參有活血化瘀、涼血功效。鹿銜草具有清熱化痰、止咳功效，現(xiàn)代藥理研究顯示，萘醌類化合物作為鹿銜草中的有效成分，能對包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多種細(xì)菌產(chǎn)生不同程度的抑菌作用，但其對金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳[9]。魚腥草有清熱解毒、排膿利尿的功效，為治療肺中有熱、痰液膿稠之要藥。體外抑菌試驗顯示，魚腥草中有效成分癸酰乙醛對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌作用[10]。夏枯草能清泄肝內(nèi)郁火、消散痰結(jié)、善泄肝膽郁火，用于肝郁化火的痰火壅聚證。王放銀等[11]用關(guān)蝶法進(jìn)行MRSA敏感性試驗，發(fā)現(xiàn)夏枯草對MRSA有一定的抑菌作用，其對MRSA的抑菌環(huán)大于萬古霉素。清金顆粒具有清熱解毒、化痰逐瘀、益氣養(yǎng)陰的功效。

本研究只觀察了清金顆粒對MRSA肺炎的干預(yù)效應(yīng)，其作用機制有待進(jìn)一步研究。此外，小鼠感染MRSA后均出現(xiàn)體質(zhì)量迅速下降后逐漸恢復(fù)，中藥組小鼠體質(zhì)量恢復(fù)較模型組低，考慮清金顆粒清熱解毒效用優(yōu)于益氣養(yǎng)陰功效，涼藥有礙脾胃運化吸收，需后續(xù)進(jìn)行長周期實驗進(jìn)一步進(jìn)行療效驗證。

綜上，我們推測清金顆粒在治療MRSA肺炎的過程中，通過對MRSA的抑菌作用減少炎性物質(zhì)的滲出，同時增強機體的免疫功能起到增效的作用。

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