3種動物源性成分陽性標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建與應(yīng)用

鄭世超，郭穎慧，董海龍，翟清燕，霍勝楠，*

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101；2.山東省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250100）

2013年，內(nèi)蒙古某食品企業(yè)使用鴨肉為原材料生產(chǎn)假劣牛肉干、羊肉干，案值超過600萬元。同年，食品安全體系完善的歐洲也曝出馬肉冒充牛肉事件[1]。2014年山東一家沃爾瑪超市又曝出使用狐貍?cè)饷俺洹拔逑泱H肉”事件。近些年來，肉類摻假問題層出不窮，個(gè)別食品生產(chǎn)經(jīng)營者為了牟取暴利，采取不法手段以次充好，以劣充優(yōu)，以假亂真，對食品進(jìn)行摻偽（摻假、摻雜、偽造的總稱）。摻加的其他肉源，不但營養(yǎng)堪憂，甚至沒有經(jīng)過檢疫或是病死畜禽肉，給百姓健康帶來了極為嚴(yán)重的影響。

熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR）方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)的一種，是目前公認(rèn)的核酸檢測最常用檢測方法之一[2]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入能特異標(biāo)記PCR產(chǎn)物的熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品進(jìn)行定量分析，實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)由定性到定量的飛躍[3]。

使用FQ-PCR技術(shù)對樣品進(jìn)行檢測時(shí)需要陽性參考物質(zhì)作為對照，以保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。因此，陽性參考物質(zhì)的質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性密切相關(guān)?，F(xiàn)階段，對于動物源性成分的檢測過程中所用的陽性參考物質(zhì)通常是動物基因組DNA[4]。提取動物源性成分基因組DNA過程復(fù)雜，制備不便、不能滿足長期貯存，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴等問題，已成為檢測方法建立和應(yīng)用的瓶頸[5]。

為了解決這個(gè)難題，眾多檢測機(jī)構(gòu)都在研究用陽性標(biāo)準(zhǔn)分子替代基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。如何利用已知序列的動物源性成分研發(fā)出容易獲取的、可大量生產(chǎn)的陽性參考物質(zhì)，以滿足肉及肉制品食品安全監(jiān)管工作的需求至關(guān)重要，動物源性成分檢測陽性標(biāo)準(zhǔn)分子是滿足當(dāng)前檢測用需要的最優(yōu)選擇[6]。陽性標(biāo)準(zhǔn)分子具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）可根據(jù)檢測需要設(shè)計(jì)引物和探針，同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時(shí)包含多個(gè)外源目的基因，可使用多重PCR反應(yīng)體系，一次性檢測多種成分；2）省去了傳統(tǒng)陽性參考物質(zhì)制備中煩瑣的動物基因組提取和鑒定步驟；3）在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測過程中，陽性標(biāo)準(zhǔn)分子根據(jù)分子量大小與動物基因組DNA分子換算，可以完成樣品中某種動物源性成分的定量分析；4）質(zhì)粒DNA純度高，避免了動物基因組制備時(shí)蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)的干擾；5）可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，易保存，不易發(fā)生變異。

《中華人民共和國食品安全法》第二十八條明確規(guī)定：禁止生產(chǎn)經(jīng)營摻假摻雜食品。不法分子為了牟取暴利，以次充好，擾亂了肉制品生產(chǎn)，損害了消費(fèi)者正當(dāng)權(quán)益。然而，現(xiàn)有食品及相關(guān)產(chǎn)品中動物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)還不夠健全，開發(fā)特異性強(qiáng)，靈敏度高的檢測方法尤為重要。本研究根據(jù)豬、牛、鴨線粒體基因保守序列設(shè)計(jì)引物、TaqMan探針，并構(gòu)建豬、牛、鴨成分特異性檢測用陽性標(biāo)準(zhǔn)分子，驗(yàn)證了方法的特異性、靈敏度與穩(wěn)定性，建立了豬、牛、鴨源性成分的定性、定量檢測方法，并對市售食品樣本進(jìn)行了豬、牛、鴨源性成分的檢測，為肉及肉制品的食品安全監(jiān)管提供了陽性材料和檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

豬肉、牛肉、鴨肉為生鮮肉，均購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶Pst I、Sal I以及限制性內(nèi)切酶緩沖液、pMD18-T載體、T4 DNA連接酶及其緩沖液、dNTPs、Taq DNA 聚合酶及其緩沖液、DL 2000Marker、Agarose Gel DNA Purification Kit、DNA提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞：大連寶生物工程有限公司；TaqMan探針及引物：上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 儀器

7500 FAST實(shí)時(shí)熒光PCR儀：美國ABI公司；NanoDrop 2000c紫外可見分光光度計(jì)、ST40臺式離心機(jī)：美國賽默飛世爾公司；comfort恒溫混勻器：德國艾本德公司；SPL-250培養(yǎng)箱：天津萊玻特瑞公司；MS204S電子天平：梅特勒公司等。

1.4 總DNA提取

采用DNeasy Blood&Tissue Kit提取豬、牛、鴨3種生鮮肉樣品的基因組DNA，用分光光度計(jì)檢測DNA純度和濃度。

1.5 PCR反應(yīng)條件

在GenBank中搜索18SrRNA基因序列和豬、牛、鴨的線粒體基因序列，根據(jù)獲得的18SrRNA基因序列和線粒體基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)兩對PCR引物，分別用于擴(kuò)增18SrRNA基因序列和線粒體基因序列[7]。以豬、牛、鴨肉基因組為模板，用所設(shè)計(jì)的引物組合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的25 μL反應(yīng)體系為起始引物（10 μmol/L）1 μL，終止引物（10 μmol/L）1 μL，引物序列見表1，模板基因組DNA 3 μL，rTaq酶預(yù)混液12.5 μL，加ddH2O調(diào)整反應(yīng)總體系體積為25 μL。反應(yīng)條件為94℃變性 5 min；94℃變性 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行40次循環(huán)。

1.6 構(gòu)建陽性標(biāo)準(zhǔn)分子

根據(jù)設(shè)計(jì)的PCR引物，采用引物對豬、牛、鴨的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到序列。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，目的產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化。將PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，4℃過夜連接。重組子命名為18S-pMD18-T及豬質(zhì)粒PCOXI-pMD18-T，牛質(zhì)粒 BCOXI-pMD18-T，鴨質(zhì)粒ANAS-pMD18-T。

將18S-pMD18-T及3種動物源性質(zhì)粒均用Sal I和Pst I進(jìn)行雙酶切。37℃水浴2 h，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，將回收片段連接。4℃過夜連接。搖床均勻混勻2 h進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行凝膠電泳分離，回收大分子質(zhì)粒條帶進(jìn)行重組克隆質(zhì)粒篩選回收。篩選得到重組克隆通過常規(guī)PCR驗(yàn)證及Sal I和Pst I的酶切驗(yàn)證及質(zhì)粒測序，最終的重組子陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子命名為豬陽性標(biāo)準(zhǔn)分子18S-PCOXI-pMD18-T，牛陽性標(biāo)準(zhǔn)分子18S-BCOXI-pMD18-T，鴨陽性標(biāo)準(zhǔn)分子18S-ANAS-pMD18-T。

1.7 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

豬、牛、鴨成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR法反應(yīng)體系：

體積為 25 μL，樣品 DNA（10 μg/mL～100 μg/mL）2 μL，引物各（10 μmol/L）0.5 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR 緩沖液 2.5 μL，水 16.7 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s，60℃退火40 s，60℃收集熒光，40個(gè)循環(huán)。用于檢測18Sr-RNA基因序列和3種動物源性成分線粒體基因序列的引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建結(jié)果

首先利用引物擴(kuò)增檢測內(nèi)參18SrRNA基因序列和線粒體基因序列。得到擴(kuò)增序列，結(jié)果見圖1～圖3，進(jìn)行測序并與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，選擇無錯(cuò)配堿基的克隆用于下一步試驗(yàn)。

圖1 豬18SrRNA和豬線粒體COXI基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of pig 18SrRNA and pig mitochondrial COXI gene amplified by PCR

圖2 牛18SrRNA和牛線粒體COXI基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of bovine 18SrRNA and bovine mitochondrial COXI gene amplified by PCR

圖3 鴨18SrRNA和鴨線粒體基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of duck 18SrRNA and duck mitochondrial DNA gene amplified by PCR

將擴(kuò)增得到的18SrRNA基因序列和線粒體基因序列通過Sal I和Pst I酶造成的特殊酶切位點(diǎn)連接到質(zhì)粒載體pMD18-T上，從而獲得豬、牛、鴨標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子（見圖4～圖6）。以質(zhì)粒分子為模板，分別用引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測序驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增序列與預(yù)期大小的片段一致。結(jié)果表明構(gòu)建的豬、牛、鴨源性陽性標(biāo)準(zhǔn)分子包含18SrRNA內(nèi)標(biāo)基因以及線粒體特異基因。

圖4 豬陽性標(biāo)準(zhǔn)分子18S-PCOXI-pMD18-T（約3.1kb）的載體結(jié)構(gòu)圖譜Fig.4 Vector structure of pig positive standard molecule 18SPCOXI-pMD18-T（about 3.1 kb）

圖5 牛陽性標(biāo)準(zhǔn)分子18S-PCOXI-pMD18-T的載體（約3.1kb）結(jié)構(gòu)圖譜Fig.5 Vector structure of bovine positive standard molecule 18SPCOXI-pMD18-T（about 3.1 kb）

圖6 鴨陽性標(biāo)準(zhǔn)分子18S-PCOXI-pMD18-T的載體（約2.9kb）結(jié)構(gòu)圖譜Fig.6 Vector structure of duck positive standard molecule 18SANAS-pMD18-T（about 2.9 kb）

表2 用于檢測18SrRNA基因序列和3種動物源性成分線粒體基因序列的引物和探針Table 2 Primers and probes for detecting 18SrRNA gene sequences and mitochondrial sequences of three animal derived components

2.2 特異性測試結(jié)果

由實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線結(jié)果可以看出，針對18Sr-RNA和線粒體基因所設(shè)計(jì)的特異性檢測用引物和探針（表2），不論對豬、牛、鴨基因組還是本發(fā)明的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子都能檢測出陽性信號。

圖7 豬陽性標(biāo)準(zhǔn)分子18SrRNA基因序列實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線對比圖Fig.7 Comparison of real-time fluorescent PCR amplification curves of pig positive standard molecular 18SrRNA gene sequences

圖8 豬陽性標(biāo)準(zhǔn)分子線粒體基因序列實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線對比圖Fig.8 Comparison of real-time fluorescent PCR amplification curves of pig positive standard molecular mitochondrial gene sequences

圖9 牛陽性標(biāo)準(zhǔn)分子18SrRNA基因序列實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線對比圖Fig.9 Comparison of real-time fluorescent PCR amplification curves of bovine positive standard molecular 18SrRNA gene sequences

圖10 牛陽性標(biāo)準(zhǔn)分子線粒體基因序列實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線對比圖Fig.10 Comparison of real-time fluorescent PCR amplification curves of bovine positive standard molecular mitochondrial gene sequences

圖12 鴨陽性標(biāo)準(zhǔn)分子線粒體基因序列實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線對比圖Fig.12 Comparison of real-time fluorescent PCR amplification curves of duck positive standard molecular mitochondrial gene sequences

以表2中的引物和探針對豬、牛、鴨基因組、陰性樣本和陽性標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，陰性樣本為30個(gè)常見動植物物種基因組，擴(kuò)增曲線結(jié)果如圖7～圖12所示。結(jié)合圖7～圖12可以看出，針對3種動物18SrRNA和線粒體基因序列所設(shè)計(jì)的引物和探針，不論對基因組還是本發(fā)明的陽性標(biāo)準(zhǔn)分子都能檢測出陽性信號。豬18SrRNA基因檢出的Ct值為豬基因組14個(gè)循環(huán)，陽性標(biāo)準(zhǔn)分子10個(gè)循環(huán)，陰性樣本則沒有信號，見圖7；豬線粒體COXI基因檢出的Ct值為豬基因組23個(gè)循環(huán)，陽性標(biāo)準(zhǔn)分子13個(gè)循環(huán)，陰性樣本沒有信號，見圖8；牛18SrRNA基因檢出的Ct值為牛基因組18個(gè)循環(huán)，陽性標(biāo)準(zhǔn)分子13個(gè)循環(huán)，陰性樣本沒有信號，見圖9；牛線粒體BCOXI基因檢出的Ct值為?；蚪M15個(gè)循環(huán)，陽性標(biāo)準(zhǔn)分子8個(gè)循環(huán)，陰性對照沒有信號，見圖10；鴨18SrRNA基因檢出線粒體基因檢出的Ct值為鴨基因組18個(gè)循環(huán)，陽性標(biāo)準(zhǔn)分子32個(gè)循環(huán)，陰性樣本沒有信號，見圖11，線粒體基因檢出的Ct值為鴨基因組19個(gè)循環(huán)，陽性標(biāo)準(zhǔn)分子26個(gè)循環(huán)，陰性樣本沒有信號，見圖12。同時(shí)對陰性樣本進(jìn)行檢測，均沒有信號，說明本發(fā)明制備的陽性標(biāo)準(zhǔn)分子能被特異性的引物和探針檢測到，具有很好的特異性。

2.3 靈敏度測試結(jié)果

對陽性標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行10倍梯度稀釋（10-1至10-7），采用表2中的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同特異性檢測相同，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)6次。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)檢測擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)分析陽性標(biāo)準(zhǔn)分子的均勻性。

總體看來，所有目標(biāo)基因曲線拐點(diǎn)清楚，指數(shù)增長期明顯，基線平穩(wěn)[8]。擴(kuò)增曲線的平行性和重復(fù)性均較為理想，基線起峰范圍適當(dāng)[9]，各檢測結(jié)果都在合適的Ct值（即cycle threshold，反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，是判斷檢測結(jié)果的重要指標(biāo)。）之間，同時(shí)也保證了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性[10]。

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)3種質(zhì)粒濃度從100 ng/μL～10-4ng/μL時(shí)，均可在40個(gè)循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光PCR顯著擴(kuò)增曲線。通常認(rèn)為，當(dāng)檢測Ct值小于35時(shí)可判斷實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果為陽性，以能夠測出樣品最低模板濃度為相應(yīng)反應(yīng)的檢測下限。結(jié)果如圖13～圖15所示，表明豬陽性標(biāo)準(zhǔn)分子的最低檢測值達(dá)到10-5稀釋度，牛、鴨陽性標(biāo)準(zhǔn)分子的最低檢測靈敏度達(dá)到10-4，說明本發(fā)明制備的陽性標(biāo)準(zhǔn)分子靈敏度較高。

圖13 豬陽性標(biāo)準(zhǔn)分子靈敏度檢測結(jié)果Fig.13 Sensitivity test results of pig positive standard molecular

圖14 牛陽性標(biāo)準(zhǔn)分子靈敏度檢測結(jié)果Fig.14 Sensitivity test results of bovine positive standard molecular

圖15 鴨陽性標(biāo)準(zhǔn)分子靈敏度檢測結(jié)果Fig.15 Sensitivity test results of duck positive standard molecular

2.4 穩(wěn)定性測試結(jié)果

一般短期穩(wěn)定性研究4周～8周，長期穩(wěn)定性進(jìn)行6個(gè)月或1年。按ISO導(dǎo)則35關(guān)于穩(wěn)定性評價(jià)的方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)。

將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子置于室溫25℃條件下，放置兩個(gè)月，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，對獲得的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析標(biāo)準(zhǔn)分子的穩(wěn)定性。對每次實(shí)時(shí)熒光測試每個(gè)反應(yīng)6個(gè)重復(fù)的Ct值平均值進(jìn)行相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分析結(jié)果見表3～表5，結(jié)果表明室溫條件下陽性標(biāo)準(zhǔn)分子儲存1周后才開始出現(xiàn)顯著性差異，而這種顯著性差異在陽性標(biāo)準(zhǔn)分子儲存超過一月后消失。因此推斷本試驗(yàn)構(gòu)建的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子熱穩(wěn)定性較好，不易降解。

表3 豬陽性標(biāo)準(zhǔn)分子穩(wěn)定性結(jié)果Table 3 Stability results of pig positive standard molecule

表4 牛陽性標(biāo)準(zhǔn)分子穩(wěn)定性結(jié)果Table 4 Stability results of bovine positive standard molecule

表5 鴨陽性標(biāo)準(zhǔn)分子穩(wěn)定性結(jié)果Table 5 Stability results of duck positive standard molecule

3 結(jié)論

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在食品檢測方面的廣泛應(yīng)用，各大實(shí)驗(yàn)室和研究機(jī)構(gòu)都積極致力于靈敏度更高、效率更高、更準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)[11]。本研究通過分析豬、牛、鴨物種特有的18SrRNA基因和線粒體基因序列，構(gòu)建了3個(gè)適于檢測豬、牛、鴨源性物質(zhì)的陽性標(biāo)準(zhǔn)分子，并對3種陽性標(biāo)準(zhǔn)分子的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證，該陽性標(biāo)準(zhǔn)分子不需要依賴于豬、牛、鴨材料的供應(yīng)，可促進(jìn)檢驗(yàn)基礎(chǔ)薄弱、技術(shù)能力有限的食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)動物源性成分檢測能力的提升，解決了食品監(jiān)管工作中缺乏陽性對照的難題。研究成果的應(yīng)用推廣將對保障我國食品安全監(jiān)督監(jiān)管發(fā)揮重要的作用，對于肉及肉制品中動物源性成分準(zhǔn)確可靠的鑒定具有重要意義和良好的應(yīng)用前景。

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