獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲HPLC測定方法研究

劉志剛，劉偉，余磊，謝曉林，劉曉燕，高蓬明，馬和喬

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽550005）

甲基硫菌靈（Thiophanate-methyl）又稱甲基托布津，屬于高效、低毒殺菌劑，具有內(nèi)吸和預防作用，廣泛用于治療各種經(jīng)濟作物的白粉病、菌核病、灰霉病等，對人體有潛在致甲狀腺癌的危害。異菌脲（Iprodione）又稱撲海因，是廣譜保護性殺菌劑，可以防治各種作物的黑穗病、黑痣病、赤星病等病害，其能在人體的胃內(nèi)產(chǎn)生硝化反應，形成硝基化合物而使人中毒。

獼猴桃富含多種營養(yǎng)素，具有增強免疫力、預防心腦血管疾病等多種生理活性功能，享有“水果之王”的美譽[1]，是近年來貴州省重點發(fā)展的特色農(nóng)產(chǎn)品之一。獼猴桃在生長過程中極易侵染軟腐病，導致在貯藏過程中發(fā)病，造成大量爛果，軟腐病已成為我國獼猴桃主產(chǎn)區(qū)種植業(yè)發(fā)展的重要制約因素[2]。病理研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃軟腐病的主要致病菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和擬菌點霉菌（Phomopsissp．）[3]，該病害侵染時期為花期和坐果期，主要途徑為疏花、疏果后害蟲造成創(chuàng)口侵染，目前主要采用甲基硫菌靈和異菌脲等農(nóng)藥進行防控，但過量的甲基硫菌靈和異菌脲會對人體產(chǎn)生潛在的危害。有文獻報道了采用紫外分光光度法、HPLC法和LC-MS法分別對甜瓜等果蔬中的甲基硫菌靈和異菌脲進行了含量測定[4-11]，目前鮮見采用HPLC法同時測定獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲含量的文獻報道。本研究采用乙腈渦旋提取樣品，建立了快速、專屬的HPLC法同時測定獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲含量，對獼猴桃鮮果及相關(guān)加工產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃樣品采自貴州省修文縣龍場鎮(zhèn)平灘村“貴長”獼猴桃種植基地。

甲基硫菌靈（HPLC級）：上海阿拉丁股份有限公司（Lot：F1228011）；異菌脲（HPLC 級）：百靈威科技有限公司（Lot：24904）；乙腈和甲醇（色譜純）：美國 Tedia公司；甲酸（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-15C型高效液相色譜儀、配二極管陣列檢測器、Labsolution色譜工作站、AUW-120D型電子天平、UV2700型紫外可見光光譜儀：日本島津公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16A型臺式高速冷凍離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；SHA-B型恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司。

1.3 樣品制備方法

1.3.1 標準溶液制備

準確稱取甲基硫菌靈標準品0.010 2 g，加乙腈溶解并定容至100 mL量瓶，即為甲基硫菌靈標準貯備液。另準確稱取異菌脲標準品0.010 5 g，加乙腈溶解并定容至100 mL量瓶，即為異菌脲標準貯備液。分別精密量取甲基硫菌靈和異菌脲儲備液各8.0 mL，用乙腈稀釋成濃度分別為8.16 μg/mL和8.40 μg/mL的混合標準溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3.2 供試品溶液制備

將獼猴桃表皮及果肉分離，稱取果肉5.0g于25mL PE離心管中，分別加入10 mL乙腈，渦旋30 s，在常溫下超聲20 min后將離心管在離心機上（10 000 r/min）離心5 min，再加入5 mL乙腈洗殘渣，合并2次提取液并用乙腈定容至25 mL量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.4 HPLC色譜條件

色譜柱 Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相為乙腈∶0.05%甲酸水溶液=60∶40（體積比），等濃度洗脫，柱溫為30℃；進樣體積 20 μL；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

精密吸取濃度分別為10.2 μg/mL和10.5 μg/mL的甲基硫菌靈和異菌脲混合標準溶液適量，依次稀釋成濃度為 0.204、0.510、1.02、2.04、5.10、10.2 μg/mL 和0.210、0.525、1.05、2.10、5.25、10.5 μg/mL 的系列標準溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣。以濃度C（μg/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，分別繪制標準曲線（見圖1），得到甲基硫菌靈回歸方程為y=99 684x-7 643.1（R2=0.999 2），異菌脲回歸方程為y=141 238.835 6x-6 868.9（R2=0.999 7）。

圖1 甲基硫菌靈和異菌脲標準曲線圖Fig.1 The standard curve of thiophanate-methyl and iprodione

2.2 精密度試驗

取濃度分別為8.16 μg/mL和8.40 μg/mL的甲基硫菌靈和異菌脲混合標準溶液，在1.4色譜條件重復進樣6次，甲基硫菌靈和異菌脲標準品代表色譜圖見圖2。甲基硫菌靈的峰面積分別為997 251、999 082、991 500、997 857、974 397 和 978 238，異菌脲的峰面積分別為 1 412 693、1 413 582、1 403 610、1 408 569、1 381 034和1 393 262，計算得RSD分別為1.04%和0.95%，說明方法精密度良好。

圖2 甲基硫菌靈和異菌脲標準品色譜圖Fig.2 Chromatograms of thiophanate-methyl and iprodione standard

2.3 檢出限

分析方法的檢出限為3倍S/N時對應的待分析物濃度，經(jīng)試驗并按實際樣品的處理過程計算得到甲基硫菌靈和異菌脲的檢測限均為0.05 μg/g。

2.4 回收率與重復性試驗

準確稱取未施用甲基硫菌靈和異菌脲的獼猴桃樣品6份，分別按照3個濃度準確加入甲基硫菌靈和異菌脲對照品各3份，按照1.3.2方法制備供試品溶液，獼猴桃樣品添加甲基硫菌靈和異菌脲標準品代表色譜圖見圖3。計算加樣回收率，甲基硫菌靈和異菌脲回收率結(jié)果分別見表1和表2，結(jié)果表明所建立方法的回收率和重復性較好。

圖3 獼猴桃樣品添加甲基硫菌靈和異菌脲標準品色譜圖Fig.3 Chromatograms of kiwifruit sample added with thiophanate-methyl and iprodione standard

表1 甲基硫菌靈回收率試驗結(jié)果Table 1 The result of recovery of thiophanate-methyl

表2 異菌脲回收率試驗結(jié)果Table 2 The result of recovery of iprodione

2.5 穩(wěn)定性試驗

取甲基硫菌靈和異菌脲混合標準溶液適量，在室溫下放置 0、2、4、6、8、10、12 h 后，在確定的色譜條件下進樣，測定甲基硫菌靈和異菌脲的色譜峰面積，分別計算RE值，由表3中結(jié)果可知，甲基硫菌靈和異菌脲溶液在室溫下放置12 h穩(wěn)定。

表3 甲基硫菌靈和異菌脲穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 3 The result of stability of thiophanate-methyl and iprodione

2.6 樣品測定

按上述樣品前處理方法和高效液相色譜條件，對采自貴州省修文縣龍場鎮(zhèn)平灘村“貴長”獼猴桃種植基地的6個不同批次“貴長”獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲含量進行檢測，結(jié)果均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲兩種農(nóng)藥的HPLC測定方法，甲基硫菌靈和異菌脲的檢出限均為0.05 μg/g，方法的專屬性和準確度良好，能夠用于檢測獼猴桃樣品中上述兩種農(nóng)藥的殘留。對采自貴州省修文縣龍場鎮(zhèn)平灘村“貴長”獼猴桃種植基地的6個不同批次“貴長”獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲含量進行檢測（該批次獼猴桃均采用甲基硫菌靈和異菌脲防控軟腐?。Y(jié)果均未檢出，檢測結(jié)果表明，采用甲基硫菌靈和異菌脲防控制獼猴桃軟腐病造成獼猴桃果實中上述兩種農(nóng)藥殘留的風險較小。

[1]黃誠,周長春,李偉.獼猴桃的營養(yǎng)保健功能與開發(fā)利用研究[J].食品科技,2007,32(4):51-55

[2]冷云星,吳文能,王瑞.獼猴桃軟腐病的發(fā)生及防治研究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學,2016,44(9):56-59

[3]李黎,陳美艷,張鵬,等.獼猴桃軟腐病的病原菌鑒定[J].植物保護學報,2016,43(3):527-528

[4]高虹,蓋崴,劉博刊.水果、蔬菜中甲基托布津的測定方法研究[J].遼寧化工,2007,36(6):431-432

[5]段文仲,郝冬生.高效液相色譜法同時測定水果中多種農(nóng)藥殘留量的方法研究[J].農(nóng)藥,1998,37(8):20-22

[6]林江麗,張麗靜,張旭龍,等.高效液相色譜法同時測定甲基托布津和撲海因[J].分析化學,2001,29(8):933-935

[7]何書海,李騰崖,陳菲.高效液相色譜法對環(huán)境樣品中甲基托布津與甲霜靈殘留的測定[J].分析測試學報,2010,29(2):161-164

[8]付新梅,張麗靜,武榮蘭,等.液相色譜-質(zhì)譜法同時測定甜瓜樣品中的噻菌靈、甲基托布津、撲海因[J].分析化學,2004,32(8):1047-1049

[9]潘艷坤,勞燕文,謝一興,等.固相萃取-高效液相色譜法對羅漢果及其提取物中甲基托布津與多菌靈的同時測定[J].分析測試學報,2010,29(2):199-202

[10]張志勇,龔勇,單煒力,等.QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃瓜和土壤中甲基硫菌靈和多菌靈[J].色譜,2012,30(1):91-94

[11]聶洪勇,黃志強,袁智能.氣相色譜法測定柑桔中甲基托布津殘留量[J].分析測試學報,1989,8(2):36-38