應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜研究白色念珠菌血流感染的血清多肽指紋圖譜

麻雅婷，楊明，何賞，陳琛，王成彬

近年來，由于大量有創(chuàng)診療技術的開展、免疫抑制劑的應用以及廣譜抗菌藥物的濫用等，真菌性血流感染和深部真菌感染的檢出率日益增高[1-2]。在真菌性血流感染的病原微生物分布中，主要以白色念珠菌為主[3-4]，由于其診斷主要依靠血培養(yǎng)，陽性率低，培養(yǎng)時間長，因此常難以早期做出臨床診斷。目前質譜技術已廣泛應用于蛋白組學研究，在腫瘤性疾病及病原微生物鑒定方面發(fā)揮了巨大作用，但應用于血流感染血清多肽方面的研究罕見報道[5]。筆者前期研究了大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌所致血流感染的血清多肽，通過比較差異多肽峰建立了相應的診斷模型[6]。為了解真菌性血流感染血清差異多肽有何不同，同時考慮到臨床真菌血流感染標本收集復雜，本研究通過建立白色念珠菌血流感染小鼠模型，應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)聯(lián)合弱陽離子交換磁珠(weak cation exchange，WCX)提取多肽技術，研究其血清多肽，并通過分析比較差異多肽峰建立相應的診斷模型，以輔助診斷真菌性血流感染。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及實驗動物 白色念珠菌標準菌株ATCC10231由解放軍總醫(yī)院微生物科惠贈。SPF級雄性ICR小鼠115只，體重25～27g，其中25只用于計算白色念珠菌半數(shù)致死量(LD50)，90只用于后續(xù)建立白色念珠菌血流感染模型，均購自北京維通利華實驗動物科技有限公司。小鼠飼養(yǎng)在ABSL2級動物室，在實驗前適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 儀器及試劑 MALDI-TOF MS質譜儀、α-氰基-4羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)及WCX磁珠均購自北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司，三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、分析級乙腈購自北京化學試劑公司，實驗用水為Milli-Q純水器制備的去離子水。

1.3 菌液配制 對白色念珠菌標準菌株進行沙保弱培養(yǎng)基平板分純，之后進行LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，將重懸的菌液配成4麥氏濁度，倍比稀釋為5個濃度梯度，用稀釋的白色念珠菌懸液經(jīng)尾靜脈注射小鼠，共5組(分別為麥氏濁度4.0、3.5、3.0、2.5和2.0)，每組5只，注射量為0.1ml/10g，連續(xù)觀察7d，每天觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)和死亡情況。之后，按Karber法計算白色念珠菌的半數(shù)致死量(LD50)。通過前期實驗所得，白色念珠菌的LD50為6.6×108CFU/ml，在建立白色念珠菌性血流感染模型時均以1/2 LD50濃度菌液感染小鼠。

1.4 動物模型的建立 小鼠隨機分為白色念珠菌感染組80只和正常對照組10只。白色念珠菌感染組注射白色念珠菌菌液，正常對照組注射無菌PBS(注射量均為0.1ml/10g)。白色念珠菌感染組分別于感染后1、3、6、12、24、48、96、168h眼球取血法收集其血液標本，5000r/min離心20min，分裝血清，每個時間點10只，–80℃儲存。

1.5 血清多肽提取 操作步驟參考多肽提取試劑盒說明書，包括結合、清洗、洗脫。具體步驟如下：①渦旋混勻WCX磁珠，將10μl血清樣品、10μl磁珠、95μl磁珠結合緩沖液混勻于0.2ml的PCR管中，室溫靜置5min后置于磁珠分離器內，靜置1min；②小心移去上清，加入100μl磁珠清洗緩沖液，充分混勻后將PCR管置于磁珠分離器內，靜置1min，小心移去上清；③重復步驟②2次；④向移去上清含磁珠的管中加入10μl磁珠洗脫緩沖液，混勻后靜置1min，將管置于磁珠分離器內，靜置1min，使磁珠吸附至管壁，吸出含有多肽的洗脫液并轉移至新的0.2ml PCR管中，–20℃低溫儲存。

1.6 MALDI-TOF MS質譜分析及數(shù)據(jù)處理 ①將1μl洗脫的多肽樣品點在ClinTOF-2靶板上，室溫干燥后將1μl基質(0.8% HCCA)覆蓋于樣品上，室溫干燥。②將靶板放入MALDI-TOF質譜儀，設置激光頻率為10Hz，能量為80mV。③用標準品校正儀器后，檢測樣品，獲得由不同質荷比(mass charge ratio，m/z)多肽峰構成的質譜圖。所得多肽指紋圖譜使用BioexplorerTM軟件分析(Bioyong科技有限公司，中國北京)。所有譜圖均經(jīng)過歸一化、基線校正和平滑處理。采用秩和檢驗比較兩組峰值強度。采用徑向基函數(shù)(RBF)神經(jīng)網(wǎng)絡算法建立區(qū)分白色念珠菌感染組和正常對照組之間的診斷模型。

2 結 果

2.1 小鼠感染后體征 小鼠在感染白色念珠菌后24h出現(xiàn)精神萎靡、活動減少等體征。小鼠在感染前體重為25～27g，感染后體重減輕為20～23g，表明小鼠白色念珠菌血流感染模型基本建立成功。

2.2 血清多肽質譜圖的檢測及對其差異多肽的分析 BioExplorerTM軟件分析白色念珠菌感染組與正常對照組的血清多肽質譜圖，共得到135個多肽峰，如圖1所示。其中有5個多肽峰隨感染時間延長呈上升趨勢，6個多肽峰隨感染時間延長呈下降趨勢，7個多肽峰隨感染時間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖2)。組合m/z 1610.9、1742.3、2666.4、2778.0、3345.1、4528.8這6個峰建立診斷模型，該模型區(qū)分30例白色念珠菌感染小鼠有24例正確分類，正確率為80.0%。

圖1 白色念珠菌感染組與正常對照組質譜圖Fig.1 Serum peptide fingerprints of C. albicans infection group and normal control group

圖2 白色念珠菌不同時間段感染血清多肽分析Fig.2 Serum peptide expressed in C. albicans infection group

2.3 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌差異多肽分析 分析比較白色念珠菌感染組和大腸埃希菌感染組的差異多肽發(fā)現(xiàn)，有9個峰在兩種感染中共同出現(xiàn)，除了在3種感染中共同出現(xiàn)的5個峰(m/z 1513.8、2910.8、3538.1、3884.9和5007.3)外，其余4個分別為m/z 2951.3、7506.1、7516.2和8200.5，其中m/z 2951.3和8200.5在大腸埃希菌感染組中高于白色念珠菌感染組，m/z 7506.1和7516.2在白色念珠菌感染組中高于大腸埃希菌感染組(表1)。分析比較白色念珠菌感染和金黃色葡萄球菌感染的差異多肽發(fā)現(xiàn)，有8個峰在兩種感染中共同出現(xiàn)，除了3種感染共同出現(xiàn)的5個峰(m/z 1513.8、2910.8、3538.1、3884.9和5007.3)外，其余3個分別為m/z 1646.8、2794.3和4106.2，且在金黃色葡萄球菌感染組中均高于白色念珠菌感染組(表2)。

表1 白色念珠菌和大腸埃希菌感染血清多肽的比較Tab.1 Comparison of serum peptide between C. albicans infection group and E. coli infection group

表2 白色念珠菌和金黃色葡萄球菌感染血清多肽的比較Tab.2 Comparison of Serum peptide between C. albicans infection group and S. aureus infection group

3 討 論

近年來，由于激素的廣泛應用及有創(chuàng)診療技術的開展，新型廣譜抗生素的使用不斷更新，免疫力低下受損的人群越來越多，使真菌性血流感染的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[7-8]，已躍居醫(yī)院獲得性感染的第4位[2,9]，其中最常見的真菌為白色念珠菌。真菌性血流感染缺乏良好的診斷方法，目前主要依靠血培養(yǎng)，但耗時長、陽性率低，導致臨床上常難以早期診斷，因此，迫切需要一種快速、敏感、高效的方法來進行輔助診斷。MALDI-TOF MS是近幾年研究蛋白組學常用的實驗方法，常用于尋找有潛在價值的生物標志物，現(xiàn)已廣泛應用于微生物鑒定、非小細胞肺癌、卵巢癌、腎臟疾病和糖尿病等方面的研究[5,10-12]，而對于血流感染引起的血清蛋白組學變化罕見報道。前期本課題組已研究了大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌造成的血流感染的血清多肽變化[6]，本研究又增加并建立了白色念珠菌引起的血流感染模型，對三者之間的差異多肽峰進行比較。

本研究分析比較了白色念珠菌感染組在不同時間段的血清多肽，發(fā)現(xiàn)隨著感染時間延長呈上升趨勢的多肽有5個，以m/z 4528.8和m/z 5457.5為例，在感染第7天時其含量為前期感染的5倍之多，提示這幾個峰可能是機體在對抗白色念珠菌感染時而產(chǎn)生的差異多肽，有望成為后續(xù)監(jiān)測和輔助診斷真菌性血流感染的指標。隨著感染時間延長呈下降趨勢的多肽有6個，以m/z 7965.9和m/z 8107.9為例，在感染初期時其含量呈高水平狀態(tài)，在感染3h時下降，在感染6～12h時其含量又上升，之后隨著感染時間不斷延長其含量呈下降趨勢，這幾個多肽峰雖然中間經(jīng)歷了短暫的小幅度變化，但從感染初期至感染7d其整體含量呈下降趨勢，提示其有望成為早期輔助診斷白色念珠菌血流感染的指標。隨著感染時間延長呈現(xiàn)先上升后下降趨勢的多肽有7個，以m/z 1742.3和m/z 2666.4為例，在感染前24h內呈階梯式上升，但到達峰值的時間基本上都在感染24h內，在感染24h后其含量呈下降趨勢，提示機體先是在感染初期有相應的蛋白產(chǎn)生，隨著機體免疫反應的出現(xiàn)，體內真菌的含量有可能下降，因此，這部分蛋白隨著感染的不斷恢復其含量也在不斷下降，可作為今后治療的監(jiān)測指標。

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌[6]和白色念珠菌3種病原微生物感染小鼠后，有5個峰出現(xiàn)了統(tǒng)一的趨勢，即在感染組中降低，在正常對照組中含量呈升高趨勢，這5個峰分別為m/z1513.8、2910.8、3538.1、3884.9和5007.3，這幾個峰的共同出現(xiàn)提示在病原微生物引起的血流感染過程中，雖然病原微生物不同，但有相似的免疫途徑被激活，而且其各自激活的程度不同，這種不同可能與病原微生物本身有一定的關系(圖3)。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌分別為血流感染中革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和真菌的常見代表菌種，其各自的組成成分有很大不同[13-14]。革蘭陰性菌和革蘭陽性菌雖然都為原核細胞性微生物，但其細胞壁組成有很大差別，筆者已在文獻[6]中予以闡述。真菌是真核細胞性微生物，首先菌體大小比原核細胞性微生物大。其次白色念珠菌是正常菌群之一，廣泛存在于人體的口腔、皮膚、黏膜、消化道、陰道和臟器中，平時不致病，在人體抵抗力和免疫力低下時成為致病菌，常見的情況包括妊娠、糖尿病、口服避孕藥、長期應用廣譜抗生素、免疫抑制劑及糖皮質激素的使用，因此，隨著有創(chuàng)診療技術的開展，真菌性血流感染的發(fā)病率日益增高[15-17]。念珠菌的致病力與以下因素有關：①黏附力：黏附力與毒力成正比，在念珠菌屬中白色念珠菌黏附力最強；②兩型性形態(tài)：當感染時，白色念珠菌常呈菌絲型，菌絲型的毒力比酵母型的毒力強；③毒素：菌細胞表面的多糖毒素和另一種被稱為“念珠菌毒素”的特殊毒素可能是致病的因素；④細胞外酶：白色念珠菌可產(chǎn)生分泌一些酶，如溶血磷脂酶、磷脂酶和細胞外酸性蛋白酶(CAP)等，其中以CAP最為重要，CAP不僅能水解蛋白質，并能水解角蛋白及膠原，具有促進白色念珠菌黏附的功能[16-18]。

圖3 感染組和正常組共有多肽峰比較Fig.3 The community of peptide expressed in infection groups and normal control group

綜上所述，本研究通過建立細菌性和真菌性血流感染模型，收集不同時期血流感染血清，應用弱陽離子交換磁珠提取多肽，MALDI-TOF MS檢測，BioExplorer軟件分析尋找差異多肽峰，建立了相應的診斷模型，為血流感染的早期診斷和潛在標志物的尋找奠定了相應的基礎，之后將繼續(xù)建立不同種類細菌的血流感染模型并收集相應的臨床標本進行驗證。

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