艾灸對新生小鼠腦卒中后抑郁模型體質(zhì)量和行為學(xué)的影響

★ 肖愛嬌 歐陽昕 陳明人

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004)

腦卒中后抑郁癥(post-stroke depression, PSD)是腦血管病的常見并發(fā)癥，是指腦卒中后出現(xiàn)以快感缺失為核心癥狀的不同程度的抑郁狀態(tài)，屬于繼發(fā)性抑郁癥的一種[1]。據(jù)報道，PSD總發(fā)生率在40%～50%[2]。PSD不僅對患者神經(jīng)功能的恢復(fù)產(chǎn)生負面影響，而且加重患者認知損害。然而目前大多研究關(guān)注成年后發(fā)生的PSD，而對于新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)后繼發(fā)的PSD研究報道較少。實際上，新生兒HIE后抑郁癥(即PSD)，除產(chǎn)生上述危害外，還可能影響兒童的生長發(fā)育，導(dǎo)致生活質(zhì)量明顯下降，給個人和家庭帶來無盡的煩惱，也給國家和社會帶來不容忽視的危害。據(jù)報道，祖國醫(yī)學(xué)的艾灸療法治療PSD具有一定的效果[3]。那么，新生小鼠PSD，其體質(zhì)量和行為學(xué)有哪些變化？艾灸對新生小鼠PSD是否具有改善作用？為此，本研究在前期HIE研究[4-6]的基礎(chǔ)上，制備PSD小鼠模型，觀察艾灸“百會”穴對PSD小鼠體質(zhì)量、行為學(xué)測試結(jié)果的影響，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 29只7d ICR新生小鼠，雌雄不限，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。首先將29只7d新生小鼠隨機分為假手術(shù)組(6只)和缺氧缺血性腦病(HIE)模型組(23只)；至術(shù)后3w時，再將存活的16只HIE模型小鼠隨機分為PSD模型組(9只)和艾灸組(7只)。PSD模型組：生后7d時，制備新生小鼠HIE模型；于術(shù)后3w時，給予HIE模型小鼠21d慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unexpected mild stimulus,CUMS)。艾灸組(C)：同PSD模型組，并于每日應(yīng)激后艾灸“百會”穴，1次/d，35min/次，共21d。假手術(shù)組，只作頸部手術(shù)，分離但不閉合頸總動脈，不缺氧，不給予CUMS。

1.1.2 主要儀器 頭戴式手術(shù)顯微鏡(DL-SSJ，中國DL公司)，恒溫監(jiān)控器(K023049，美國Harvard儀器公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，國華電器有限公司)，動物行為跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT，荷蘭Noldus公司)。

1.2 方法

1.2.1 PSD模型制備 分兩步進行。

首先，制備HIE新生小鼠模型，參照文獻[4-6]進行。7d新生小鼠在異氟烷吸入麻醉狀態(tài)下行頸部正中切口，分離、閉合左側(cè)頸總動脈，縫合傷口；術(shù)后動物在室溫中恢復(fù)和母乳喂養(yǎng)2h后，進行缺氧處理，即將動物置于37℃密閉艙，通入氮氣(N2)，調(diào)節(jié)氧氣濃度為8%，100 min后將動物取出。

其次，制備PSD小鼠模型。自術(shù)后3w始，給予HIE模型小鼠21d CUMS。CUMS具體操作按Willner等[7]的方法并稍加改進，將動物每周隨機給予冰水游泳(4℃，3min)、束縛(1h)、搖晃(30min)、夾尾(1 min)、禁水(24h)、禁食(24h)，晝夜顛倒，以制備PSD小鼠模型。

1.2.2 艾灸取穴與方法 將艾灸組小鼠頭部的毛發(fā)剪去，露出“百會”[8]，作為艾灸穴位。

艾灸方法：用直徑0.4cm，長10cm的艾條(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制)，距穴位2cm左右溫和灸小鼠，1次/ d，35min/次，共21d。

1.2.3 小鼠體質(zhì)量稱量 于應(yīng)激前1d、應(yīng)激1w和3w時使用分析天平進行體質(zhì)量稱量。

1.2.4 小鼠行為學(xué)觀察 ①Open-Field測試：于應(yīng)激前1d、應(yīng)激1w和3w時，用自制的敞箱進行測試。以小鼠穿越的格子數(shù)作為水平活動得分(crossing)，動物穿越1格為1分，如動物沿線行走，每10cm為1分。以直立次數(shù)為垂直活動得分(rearing)，雙前肢離地為1分。每只動物測試1次，3min/次。Open-Field測試中的水平活動得分反映小鼠的活動度，垂直活動得分反映小鼠對周圍事物的興趣高低。

②蔗糖水?dāng)z入量測試：于應(yīng)激前1d、應(yīng)激1w和3w時進行測試。每只動物同時放入飲用水和1%的蔗糖水，1h后稱量各只小鼠的飲用水量及蔗糖水消耗量，計算糖水消耗百分比。糖水消耗試驗反映小鼠對獎賞的快感反應(yīng)。

③空間學(xué)習(xí)記憶力測試：于艾灸治療結(jié)束后，采用Morris水迷宮測試小鼠的逃避潛伏期，2次/d，連續(xù)5d。測試方法：將測試時間設(shè)置為60s，操作者分別從兩個入水點將小鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄小鼠在60s內(nèi)找到并爬上平臺所需的時間，即逃避潛伏期。小鼠如果在60s內(nèi)仍未找到平臺，則將其牽引至平臺停留10s，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)記憶，潛伏期記為60s。逃避潛伏期越短，學(xué)習(xí)記憶力越好。

2 結(jié)果

2.1 艾灸對PSD模型小鼠體質(zhì)量的影響 從表1可以看到，于應(yīng)激前1d，假手術(shù)組小鼠的體質(zhì)量均高于模型組、艾灸組小鼠(P<0.05)，而模型組、艾灸組兩組之間體質(zhì)量無明顯差別(P>0.05)；應(yīng)激1w時，3組小鼠體質(zhì)量增長速度不一致，假手術(shù)組小鼠呈現(xiàn)較快增長,與模型組、艾灸組之間均具有明顯差別(P<0.05)，而模型組、艾灸組小鼠體質(zhì)量增長緩慢，尤以模型組增長更慢,后兩者之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；應(yīng)激3w時，假手術(shù)組小鼠體質(zhì)量與模型組、艾灸組相比均具有明顯差別(P<0.05),但艾灸組小鼠體質(zhì)量增長速度快于模型組，與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.2 艾灸對PSD模型小鼠行為學(xué)測試結(jié)果的影響

2.2.1 艾灸對PSD模型小鼠Open-Field測試結(jié)果的影響 從表2可以看出，應(yīng)激前1d，假手術(shù)組、模型組和艾灸組小鼠Open-Field測試結(jié)果之間無顯著差異。應(yīng)激1w、3w時，模型組小鼠水平活動和直立活動得分均減少，尤其是直立活動得分明顯減少，于應(yīng)激3w時與假手術(shù)組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P﹤0.05)；而艾灸組無論是水平活動得分和直立活動得分均高于模型組小鼠，于應(yīng)激3w時，其水平活動得分與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見表2。

表1 艾灸對PSD模型小鼠體質(zhì)量的影響比較 /g

注：*P<0.05 與假手術(shù)組相比；△P<0.05 與模型組相比。

表2 艾灸對PSD模型小鼠Open-Field測試結(jié)果的影響

注：與假手術(shù)組相比,*P<0.05;與模型組相比,△P<0.05。

2.2.2 艾灸對PSD模型小鼠蔗糖水消耗量的影響 從表3中可知，應(yīng)激前1d，各組小鼠糖水消耗百分比比較接近。自應(yīng)激開始后，假手術(shù)組小鼠糖水消耗百分比保持較高比例；而模型組糖水消耗百分比隨著刺激時間的延長逐漸降低，于應(yīng)激3w時與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；艾灸組在應(yīng)激1w時對糖水的攝入量呈下降趨勢，而在治療一段時間后，攝入量緩慢上升，于應(yīng)激3w時與假手術(shù)組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 艾灸對PSD模型小鼠蔗糖水消耗百分比的影響比較 %

注：與假手術(shù)組相比,*P<0.05。

2.2.3 艾灸對PSD模型小鼠逃避潛伏期的影響 從表4中可知，第1d、2d測試，各組小鼠平均逃避潛伏期均比較接近。自第3d至第5d，假手術(shù)組小鼠平均逃避潛伏期呈下降趨勢；模型組小鼠的逃避潛伏期基本上均長于假手術(shù)組小鼠，至第5d，與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；與模型組相比，艾灸組小鼠的逃避潛伏期迅速下降，至第5d時，與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P﹤0.05)。結(jié)果見表4。

3 討論

PSD是腦卒中常見的并發(fā)癥之一, 據(jù)報道，PSD總發(fā)生率在40%～50%[2]。PSD主要表現(xiàn)為興趣減退、易疲勞、思維遲緩、食欲減退、悲觀絕望, 甚至出現(xiàn)自殺企圖和行為等, 直接影響患者的生活質(zhì)量和功能康復(fù)。然而大多數(shù)研究關(guān)注成年后發(fā)生的PSD，而對于新生兒HIE后繼發(fā)的PSD研究報道較少。HIE是新生兒時期較為常見的疾病之一，是指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷[9]，預(yù)后差，具有較高致死率和致殘率[10-11]。據(jù)資料統(tǒng)計，新生兒HIE發(fā)生率為2～3‰(足月產(chǎn))[12-13]，死亡率約為20%～50%[14]，幸存患者常伴有生長發(fā)育遲緩、永久性神經(jīng)功能障礙以及心理障礙(如抑郁)等。可見，新生兒HIE后出現(xiàn)PSD，除產(chǎn)生上述危害外，還可影響兒童的生長發(fā)育。

表4 艾灸對PSD模型小鼠逃避潛伏期的影響比較 s

注：**P<0.01 與假手術(shù)組相比；△P<0.05 與模型組相比。

許多疾病的研究都得益于成功的動物模型。目前，成年鼠PSD模型制備多采用腦卒中伴抑郁的復(fù)合模型[1]，即采用線栓法制備局灶性腦缺血動物模型，再加上CUMS制備PSD模型[15-17]，或者采用開顱去除大鼠腦皮層血管致腦缺血模型，再加上CUMS制備PSD模型[18]。但有關(guān)新生鼠HIE后出現(xiàn)PSD的研究報道很少。本文參照文獻[15-18]，采用新生小鼠HIE伴抑郁的復(fù)合模型，即制備新生小鼠HIE模型，再加CUMS制備PSD模型。HIE模型參照文獻[4-6]進行，而抑郁模型參照文獻[7]進行。實驗結(jié)果觀察到：應(yīng)激前1d、應(yīng)激1w和應(yīng)激3w PSD模型小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，與假手術(shù)組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異。推測應(yīng)激前1d PSD模型組體質(zhì)量減輕可能是由于單純腦卒中導(dǎo)致飲食下降引起，而應(yīng)激1w和應(yīng)激3w體質(zhì)量的降低，則可能與腦卒中后引起的抑郁導(dǎo)致。通常情況下，敞箱試驗的水平活動得分反映動物的活動水平，垂直活動得分反映動物對新鮮事物的好奇程度，即興趣的高低；糖水消耗試驗降低反映動物快感缺乏；尋找平臺潛伏期延長反映動物空間學(xué)習(xí)記憶力下降。本研究實驗結(jié)果顯示：隨著應(yīng)激時間的延長，PSD模型小鼠水平活動和垂直活動得分逐漸減少、糖水消耗量逐漸降低、尋找平臺潛伏期延長；至應(yīng)激3w時，模型組小鼠的直立活動得分明顯減少(P<0.05)、糖水消耗量降低(P<0.05)、空間學(xué)習(xí)記憶力下降(P<0.05)，與假手術(shù)組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異。由此認為，在HIE造模的基礎(chǔ)上給予CUMS，動物出現(xiàn)生長緩慢，自發(fā)活動和探究活動減少、快感缺失、空間學(xué)習(xí)記憶力降低，提示小鼠PSD模型制備成功。

研究報道，艾灸療法治療成年鼠PSD具有較好的療效[3]。本課題組前期研究也觀察到，艾灸具有改善大鼠抑郁癥的效果[19-20]。那么，艾灸對HIE后出現(xiàn)的PSD是否具有改善作用呢？本研究觀察了艾灸“百會”穴35min對PSD模型小鼠的防治效果。結(jié)果顯示：給予艾灸治療后，艾灸組小鼠體質(zhì)量有所增加，于應(yīng)激3w時與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。此外，隨著應(yīng)激時間的延長，艾灸小鼠水平活動和垂直活動得分逐漸增多、糖水消耗量逐漸增加、尋找平臺潛伏期縮短；至應(yīng)激3w時，模型組小鼠的水平活動得分明顯增多(P<0.05)、糖水消耗量增加、空間學(xué)習(xí)記憶力提高(P<0.05)。表明艾灸對HIE導(dǎo)致的PSD同樣具有改善作用。

綜上所述，我們認為新生小鼠在HIE造模的基礎(chǔ)上給予CUMS可成功制備PSD模型。而艾灸可能通過艾灸穴位，調(diào)動機體內(nèi)源性的抗病機制，達到改善PSD的效果。然而關(guān)于艾灸防治PSD的具體作用機制還有待于將來進一步的研究。

[1]何曉山,林青,周寧娜,等.腦卒中后抑郁常用動物模型[J].醫(yī)學(xué)信息,2011,24(3):1 459-1 461.

[2] Pohjasvaara T, Lepp vuori A, Siira I, et al. Frequency and clinical determinants of post-stroke depression[J]. Stroke, 1998, 29(11):2311-2317.

[3]駱彤,汪武生.艾灸治療中風(fēng)后抑郁癥的臨床研究[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育,2011,9(8): 140-141.

[4]Xiao AJ, Chen W, Xu B, et al. Marine Compound Xyloketal B Reduces Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury[J]. Marine Drugs,2015,13(1):29-47.

[5]Xu B,Xiao AJ,Chen W,et al. Neuroprotective Effects of PSD-95 Inhibitor in Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury[J]. Molecular Neurobiology.2016,53(9):5 962-5 970.

[6]肖愛嬌,康明非,汪建民,等.新生小鼠缺氧缺血性腦病腦組織caspase-3表達的變化[J].天津醫(yī)藥,2015,43(10): 1 116 -1 118.

[7]Willner P, Towell A, Sampson D, et al. Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress, and its restoration by a tricyclic antidepressant[J].Psychopharmacology (Berl),1987,93(3): 358-364.

[8]李忠仁.實驗針灸學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:327-329.

[9]薛辛東,杜立中.兒科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:120-121.

[10]Nelson K.Neonatal encephalopathy:etiology and outcome[J].Dev Med Child Neurol,2005, 47(5): 292.

[11]Natarajan G, Shankaran S, Laptook A, et al. Apgar scores at 10 min and outcomes at 6-7 years following hypoxic-ischaemic encephalopathy[J].Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed,2013,98(6): 473-479.

[12]Vannucci R. Experimental Biology of Cerebral Hypoxia-Ischemia: Relation to Perinatal Brain Damage[J].Pediatr Res,1990,27(4):317-326.

[13]Filippi L, Fiorini P, Daniotti M, et al. Safety and efficacy of topiramate in neonates with hypoxic ischemic encephalopathy treated with hypothermia (NeoNATI)[J].BMC Pediatr,2012(12):144-154.

[14]Vannucci R. Hypoxic-ischemic encephalopathy[J].Am J Perinatol, 2000,17(3):113 -120.

[15]劉福友,楊石,陳衛(wèi)垠,等. 腦卒中后抑郁大鼠模型的建立[J].中國臨床康復(fù),2006,10(42):91-94.

[16]洪華,黃如訓(xùn),王庭槐,等.腦卒中后抑郁大鼠模型的建立[J].中國臨床康復(fù),2002,6(9):1 266-1 267.

[17]倪貴華,邵蓓,范虹.卒中后抑郁實驗動物模型的研究[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2006,36(6):524-526.

[18]唐啟盛,裴清華,侯秀娟,等.腦卒中后抑郁狀態(tài)動物模型的建立[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2004,27(3):33-36.

[19]肖愛嬌,康明非,陳日新,等.熱敏灸對抑郁癥模型大鼠行為學(xué)的影響[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2011,23(4):24-28.

[20]肖愛嬌, 鄒宏昌.艾灸對抑郁癥模型大鼠色氨酸羥化酶2基因表達與單胺氧化酶活性的影響[J].中華行為醫(yī)學(xué)科學(xué)與腦科學(xué)雜志,2012,21(2):126-128.