猴耳環(huán)抗炎鎮(zhèn)痛活性部位的篩選

★ 關(guān)潤(rùn)霞 申作潔 歐陽勝

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)學(xué)科組 南昌 330004；2.江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系 南昌 330052)

猴耳環(huán)為豆科含羞草亞科猴耳環(huán)屬植物猴耳環(huán)PithecellobiumclypeariaBenth.的幼枝、葉，又名圍涏樹、尿桶公、蛟龍木、婆劈樹等，多年生喬本植物，生于山野叢林中。分布于廣東、福建、浙江、廣西、云南、臺(tái)灣[1]。猴耳環(huán)味微苦、澀，微涼，具有清熱解毒，去濕斂瘡，涼血消腫的功效。民間多用來治燒燙傷，瘡癰癤腫[2]?，F(xiàn)代臨床上用于急性扁桃體炎、急性咽喉炎、上呼吸道感染、急性腸胃炎、慢性腸炎、手足口病[3-8]等癥。其單方制劑——猴耳環(huán)消炎顆粒作為抗炎及呼吸道疾病用藥已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，其處方為猴耳環(huán)嫩枝葉的水提浸膏[9]。迄今尚未見有關(guān)猴耳環(huán)抗炎鎮(zhèn)痛藥理活性的研究報(bào)道。本研究對(duì)猴耳環(huán)總提物及各萃取部位進(jìn)行抗炎、鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)，并從中篩選出有效部位，為猴耳環(huán)進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)km小鼠，體重18～22g，雌雄兼有；雄性SD大鼠，體重180～220g，均購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK(湘)2013-0004。

1.2 主要儀器 UV 9100 A紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)，HH-S2精密恒溫水浴鍋(中國江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)，DZF-6050真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，BS 124S分析天平，TE4101-L電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.3 藥品與試劑 猴耳環(huán)水提物總浸膏，由杏林白馬藥業(yè)提供，阿司匹林腸溶片，南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司，規(guī)格25mg/片，批號(hào)150707；醋酸地塞米松片，浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格0.75mg/片，批號(hào)150405；戊巴比妥鈉，規(guī)格5g，貨號(hào)701O032；伊文斯蘭染色液(0.5%)，規(guī)格100mL，貨號(hào)G1810；二甲苯，冰醋酸，羧甲基纖維素鈉，乙酸乙酯，正丁醇，均為分析純。

2 方法

2.1 猴耳環(huán)不同提取部位的制備 猴耳環(huán)水提物總浸膏2kg，由杏林白馬藥業(yè)提供，提取率6.67%。取總浸膏1.5kg溶于適量水中，先后用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑得乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位浸膏分別為200g，200g，384.6g。

猴耳環(huán)水提物總浸膏、乙酸乙酯部位、正丁醇部位浸膏用時(shí)以0.5%CMC-Na溶液配制，水部位浸膏用純凈水溶解配制。

2.2 抗炎作用

2.2.1 小鼠耳腫脹法[10]將72只雄性km小鼠，按體重隨機(jī)分為6組：模型組、阿司匹林陽性對(duì)照組、猴耳環(huán)總提物組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組和水部位組。各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7d，于末次給藥1h后，將二甲苯0.03mL均勻涂于小鼠右耳正反兩面，30min后頸椎脫臼處死，剪下雙耳，用8mm直徑打孔器取相同部位耳片并稱重，兩耳片的質(zhì)量差為耳腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率。

耳腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量

耳腫脹抑制率=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%

2.2.2 大鼠棉球肉芽腫法[10]將60只雄性SD大鼠按體重隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為模型組、醋酸地塞米松對(duì)照組、猴耳環(huán)總提物組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組和水部位組。大鼠麻醉后腹部中央用消毒酒精消毒，剪1cm長(zhǎng)小口，將兩個(gè)20mg的滅菌棉球(10mg/mL氨芐西林液浸泡)分別植入大鼠兩側(cè)腹股溝，縫合傷口后次日灌胃給藥，連續(xù)7d，末次給藥1h后將大鼠頸椎脫臼處死，取出棉球，干燥，稱兩個(gè)棉球質(zhì)量，取其平均值。將平均質(zhì)量減去棉球原質(zhì)量即得肉芽腫質(zhì)量，計(jì)算肉芽腫抑制率。

肉芽腫抑制率=(模型組肉芽腫質(zhì)量-給藥組肉芽腫質(zhì)量)/模型組肉芽腫質(zhì)量×100%

2.2.3 猴耳環(huán)不同部位對(duì)毛細(xì)血管通透性的影響[11]分組及給藥方法同“2.2.1”項(xiàng)，各組于末次給藥1h后，尾靜脈注射0.5%伊文斯蘭(0.1mL/10g)，同時(shí)腹腔注射0.8%冰醋酸0.2mL，30min后處死小鼠，腹腔注射6mL生理鹽水，抽取腹腔液于4℃放置6h，取其上清液，用紫外可見分光光度計(jì)(590nm)測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算抑制率。

抑制率=(模型組A值-給藥組A值)/模型組A值×100%

2.3 鎮(zhèn)痛作用

2.3.1 熱板法[10]將雌性小鼠放置溫度(55±1)℃的金屬板并記錄出現(xiàn)舔后足反應(yīng)所需時(shí)間(基礎(chǔ)痛閾)，大于30s或是小于5s或是跳躍的剔除。取篩選合格的小鼠72只，按體重隨機(jī)分為6組，每組12只。按“2.2.1”項(xiàng)方法給藥，分別于末次給藥30min、60min、90min、120min測(cè)定小鼠痛閾值，如果用藥后在熱板上60s仍無反應(yīng)，將小鼠取出，按60s計(jì)算。

2.3.2 醋酸扭體法[10]分組及給藥方法同“2.2.1”項(xiàng)，于末次給藥1h后，腹腔注射新鮮配制的0.8%醋酸0.2mL/只。記錄各組小鼠注射醋酸溶液后15min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)，并計(jì)算抑制率。

抑制率=(模型組扭體反應(yīng)數(shù)-給藥組扭體反應(yīng)數(shù))/模型組扭體反應(yīng)數(shù)×100%

3 結(jié)果

3.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 與模型組相比，猴耳環(huán)總提物組、乙酸乙酯部位組和正丁醇部位組有顯著性差異(P<0.01)，對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹有明顯抑制作用，抑制率分別為36.34%、30.11%、43.71%；水部位組與模型組的腫脹度無顯著差異(P>0.05)，見表1。

組別劑量/g·kg-1腫脹度/mg抑制率/%模型組—22.19±3.26—阿司匹林0.207.18±2.16**67.67猴耳環(huán)總提物5.0014.13±3.11**36.34猴耳環(huán)乙酸乙酯部位5.0015.51±3.47**30.11猴耳環(huán)正丁醇部位5.0012.49±3.63**43.71猴耳環(huán)水部位5.0018.25±3.3517.76

注：與模型組組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.2 對(duì)大鼠棉球所致肉芽腫的影響 與模型組比較，猴耳環(huán)總提物組和正丁醇組對(duì)大鼠棉球所致肉芽腫有有顯著差異(P<0.01)，對(duì)大鼠棉球致肉芽腫增生有明顯抑制作用，抑制率分別為18.53%、25.05%；水部位組與模型組的肉芽腫質(zhì)量無顯著差異(P>0.05)，見表2。

組別劑量/g·kg-1肉芽腫質(zhì)量/mg抑制率/%模型組—27.46±3.93—醋酸地塞米松0.018.01±1.54**70.85猴耳環(huán)總提物3.5022.37±2.80**18.53猴耳環(huán)乙酸乙酯部位3.5023.31±3.09*15.13猴耳環(huán)正丁醇部位3.5020.58±2.33**25.05猴耳環(huán)水部位3.5023.80±5.3413.33

3.3 對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 與模型組比較，猴耳環(huán)不同提取部位均有不同程度降低小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性作用，其中猴耳環(huán)總提物和正丁醇部位活性較強(qiáng)，抑制率分別為41.35%、47.73%；與陽性藥組比較，總提物組和正丁醇部位組腹腔液A值無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 猴耳環(huán)不同提取部位對(duì)醋酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性的影響

3.4 對(duì)熱板法致小鼠疼痛的影響 與模型組相比，給藥前各組痛閾值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；猴耳環(huán)總提物組和正丁醇部位組給藥后60、90、120min明顯延長(zhǎng)熱板所致小鼠的痛閾值(P<0.05、0.01)，阿司匹林組給藥后30、60、90、120min顯著延長(zhǎng)熱板法所致小鼠的痛閾值(P<0.01)；水部位組與模型組的痛閾值無顯著差異(P>0.05)，見表4。

3.5 對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響 與模型組比較，猴耳環(huán)不同提取部位均有顯著的扭體抑制作用(P<0.05、0.01)，其中猴耳環(huán)總提物和正丁醇部位活性較強(qiáng)，抑制率分別為43.03%、49.27%；阿司匹林也有顯著的作用(P<0.01)，扭體抑制率為67.46%，見表5。

表4 猴耳環(huán)不同提取部位對(duì)小鼠熱板法痛閾值影響

組別劑量/g·kg-1扭體次數(shù)/次抑制率/%模型組—41.73±6.57—阿司匹林0.2013.58±2.75**67.46猴耳環(huán)總提物5.0023.75±4.79**43.03猴耳環(huán)乙酸乙酯部位5.0032.36±5.07**22.45猴耳環(huán)正丁醇部位5.0021.17±4.02**49.27猴耳環(huán)水部位5.0031.27±6.51*16.34

4 討論

猴耳環(huán)具有清熱解毒、收濕斂瘡的功效，是治療多種熱毒癥候獨(dú)特的南方藥材，民間傳統(tǒng)以猴耳環(huán)枝葉煮水洗瘡及化膿性傷口、濕疹等。本文主要從抗炎、鎮(zhèn)痛兩方面開展猴耳環(huán)藥理活性研究，以探明其抗炎鎮(zhèn)痛作用的有效部位?？寡啄Ｐ蛯?shí)驗(yàn)結(jié)果表明猴耳環(huán)總提物和正丁醇部位能明顯減輕二甲苯所致小鼠耳腫脹，抑制棉球致大鼠肉芽腫增生，明顯抑制醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加，顯示良好的抗炎作用。鎮(zhèn)痛模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示猴耳環(huán)總提物和正丁醇部位灌胃給藥能明顯延長(zhǎng)熱板法所致小鼠的痛閾值，并明顯減少小鼠扭體次數(shù)，顯示其有良好的鎮(zhèn)痛作用。由于猴耳環(huán)正丁醇部位在抗炎、鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中均顯示最強(qiáng)的藥理活性，表明該部位具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛活性。目前已上市的猴耳環(huán)消炎顆粒、猴耳環(huán)消炎片等均為猴耳環(huán)水提物總浸膏，其有效部位尚未明確。本文通過一系列抗炎鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)從猴耳環(huán)水提物總浸膏和各部位中篩選出其正丁醇部位為明確有效部位，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為尋找其有效成分及制定藥材、制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但有關(guān)猴耳環(huán)的抗炎鎮(zhèn)痛機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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