丹參酮IIA聚乙二醇化納米脂質載體的制備及理化性質研究

★ 孫福娟 于凡 姚文琪 李國轉 李旭 吳孟 陳衛(wèi)東

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院 合肥 230012)

丹參酮ⅡA(tanshinone IIA，TA)是從中藥丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖中提取分離的二萜醌類化合物，其具有廣泛的生理活性，如抗腫瘤、保護心腦血管、抗氧化、抗菌、保腎保肝等作用[1-5]，且不良反應較少。然而丹參酮IIA難溶于水，口服胃腸吸收差，生物利用度低，嚴重限制其療效的發(fā)揮[6]。納米脂質載體(nano structured lipid carrier，NLC)是在一定溫度下將固態(tài)脂質和空間上不相容的液態(tài)脂質混合，在固體脂質納米粒(solid lipid nano particles,SLN)的基礎上發(fā)展而來的第二代脂質納米載體。據(jù)報道，NLC已被視作是脂質體和SLN的優(yōu)良替代物，其具有較強的藥物保護作用，便于長期儲存，可明顯提高口服生物利用度，并改變藥物在體內(nèi)的分布[7-8]。但是，NLC進入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)會被單核細胞吞噬系統(tǒng)(MPS)視作異物進而被吞噬，大大縮短了納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時間[9]。近年來，眾多研究者選用含聚乙二醇(PEG)的材料對納米粒表面進行修飾，從而躲避MPS的吞噬。同時，PEG還具有改善納米粒親水性從而達到長循環(huán)、提高納米粒穩(wěn)定性等優(yōu)點[10-12]。

因此課題組從藥劑學方面著手，結合長循環(huán)納米載體的優(yōu)點，制備丹參酮IIA聚乙二醇化納米脂質載體，以期達到改善口服胃腸吸收，提高生物利用度的目的，為后續(xù)劑型的研究提供參考依據(jù)，擴大丹參酮IIA在臨床方面的應用。

1 材料

1.1 儀器 LC-16C高效液相儀(日本島津)；AB135-S型十萬分之一天平(德國梅特勒-托利多公司)；DF-101B數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；XW-80A微型渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LC-4016型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；超濾離心管(美國Milipore)；Zetasizer Nano ZS 90粒度測定儀(英國馬爾文公司)；透射電子顯微鏡(TEM，JEM-100SX，日本JEOL公司)。

1.2 試劑 丹參酮IIA原料藥(純度≥98%，西安鴻生生物技術有限公司，批號 140320)；丹參酮IIA標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號 110766-200619)；單硬脂酸甘油酯、聚乙二醇硬脂酸(湖南爾康制藥股份有限公司)；中鏈脂肪酸(廣州市宏晟化工原料有限公司)；蛋黃卵磷脂(安徽豐原醫(yī)藥公司)；聚山梨酯-80(國藥集團化學試劑有限公司)；葡聚糖凝膠G-50(北京恒輝科技有限公司)；甲醇(色譜純，上海信可有限公司)；無水乙醇(上海蘇懿化學試劑有限公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 NLC的制備 通過前期預實驗考察，本實驗最終選用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備TA-P-NLC。操作如下：將處方量的GMS、PEG-SA、MCT、卵磷脂和TA溶于5mL無水乙醇中，水浴加熱升溫至70℃構成油相；再將一定量的T-80溶于15mL超純水中，水浴加熱至與油相同溫，構成水相。用1mL注射器將水相緩慢勻速地注入到正在攪拌(1000r/min)的油相中，攪拌時間為2.5h。待有機溶劑完全揮發(fā)后，將乳液迅速轉移至盛有20mL冰水的錐形瓶中，繼續(xù)攪拌1.5h，即得TA-P-NLC。

2.2 TA分析方法的建立 經(jīng)紫外掃描，確定檢測波長為270nm。經(jīng)優(yōu)化確定色譜條件為：流動相為甲醇-水(85∶15)，進樣量20μL，流速1.0 mL/min，柱溫30℃。該條件下，進行方法學考察。由實驗結果可知，溶劑、輔料等對TA的測定無干擾，專屬性較好；丹參酮IIA在0.1～32.0μg/mL與峰面積呈良好線性關系，回歸方程為Y=136492X+50189(r=0.9992)；低、中、高(0.10、1.0、10.0 μg/mL)3個質量濃度的日內(nèi)精密度RSD分別為1.45%、0.53%、1.37%，日間精密度RSD分別為0.64%、1.38%、1.26%；1.6、2.0、2.5μg/mL 3種質量濃度的平均回收率為(100.02±0.94)%，RSD分別為1.65%、1.25%、1.66%；平行制備供試液6份并逐個進樣，峰面積RSD值為1.28%，重復性良好；室溫下溶液8h內(nèi)穩(wěn)定性較好(RSD=1.46%)。上述結果均符合方法學要求，表明該分析方法適合丹參酮IIA含量的測定。

2.3 包封率的測定 取活化好的葡聚糖凝膠(Sephadex G-50)適量，裝入底部墊有兩層濾紙片的注射器中。待水分自然流下，將其置于低速離心機中，梯度離心使凝膠柱失水皺縮，得到Sephadex G-50微型柱。取TA-P-NLC 500μL，上樣于微柱頂部，3000r/min離心3 min，再于柱頂加相同體積的超純水，連續(xù)洗脫4次并收集濾液，加甲醇破乳并定容到3 mL，進樣分析并計算NLC內(nèi)已包裹的TA的質量(M1)。另取未過柱的TA-P-NLC 500μL，先加0.8mL的超純水，再加適量甲醇并定容到3mL，同法分析并計算體系中總的TA質量(M0)。

(包封率=M1/ M0×100%)。

2.4 正交試驗 本實驗篩選出3個主要影響因素：GMS與PEG-SA的質量比(A)、MCT占總脂質的質量分數(shù)(B)、卵磷脂質量濃度(C)。每個因素各取三個水平，根據(jù)正交試驗設計的原理，以包封率作為評價指標，按照L9(34)正交表設計安排試驗，因素水平表見表1，正交設計結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交設計包封率的結果(Mean±SD, n=3)

表3 方差分析

由表2可知，各因素對包封率的影響大小依次為A1>A2>A3，B2>B1>B3，C3>C1>C2；比較極差值可以發(fā)現(xiàn)，各因素對實驗結果的影響大小順序為A>B>C。同時分析表3可知，因素A對包封率影響顯著。因此，最優(yōu)處方組合為A1B2C3，即PEG-SA占總脂質質量的4%，MCT占總脂質質量的60%，卵磷脂用量為22g/L，T-80含量為2g/L。

2.5 驗證試驗 按照最優(yōu)處方及工藝，平行制備3批TA-P-NLC，并按“2.2”下方法測定，包封率分別為83.49%、84.28%、85.37%。結果表明該工藝重復性較好。

2.6 TA-P-NLC理化性質研究

2.6.1 形態(tài)學考察 將所制得的TA-P-NLC溶液，滴加適量于銅網(wǎng)上，自然晾干后置于透射電鏡下觀察納米粒顯微形態(tài)。從圖1可見，TA-P-NLC納米粒呈較規(guī)則的球形，粒子之間無粘連。

2.6.2 粒徑及Zeta電位的測定 在室溫條件下，取TA-P-NLC溶液適量，用超純水稀釋10倍后，將其置于樣品池中。使用納米激光粒度儀測定粒徑和Zeta電位，粒徑分布及Zeta電位分別見圖2～3。由圖可知，TA-P-NLC平均粒徑為218.8nm，且多分散系數(shù)小于0.3，說明納米粒粒度分布均勻；膠體分散系統(tǒng)中常用Zeta電位評價其物理穩(wěn)定性，一般來說，高表面電荷證明粒子之間具有較強的斥力，在水溶液中會更加穩(wěn)定[13]。本實驗制備的TA-P-NLC Zeta電位為-34.3mV，穩(wěn)定性較好，利于儲存。

圖1 TA-P-NLC的透射電鏡圖

圖2 TA-P-NLC粒徑分布

圖3 TA-P-NLC Zeta電位

2.6.3 DSC分析 以空白鋁鍋作為對照，在氮氣氣氛下，以10℃/min的速率在一定溫度范圍內(nèi)掃描，分別對TA、GMS、PEG-SA、TA-P-NLC進行DSC分析，使用Origin9.0軟件分析數(shù)據(jù)，結果見圖4。熱解曲線顯示，TA的特征吸熱峰在207℃左右；GMS、PEG-SA的吸熱峰分別為56.5、47.4 ℃；TA-P-NLC曲線圖中，TA的吸熱峰已消失，且無GMS、PEG-SA的吸熱峰，而在110.4℃左右出現(xiàn)一新的吸熱峰。由此說明，TA被NLC成功包載，納米粒已經(jīng)形成，構成一新的物相。

圖4 熱解曲線

2.6.4 體外釋放度考察 精密量取TA-P-NLC和TA溶液各5mL置于預先處理好的透析袋中，將兩端夾緊，放置在盛有50mL含1%吐溫80的PBS(pH7.4)的溶出器皿中，溫度為37℃，轉速為100r/min，平行操作3份。分別在0,1,2,3,4,5,6,7,8,12,20,30,48h取樣0.5mL，同時快速補加同溫同體積的新鮮釋放介質，過0.45μm微孔濾膜后進樣分析，并計算累積釋放量Q。Q=[Ci×V1+(C1+C2+…Ci-1)×V2]/M×100%。

式中C1、C2、Ci-1、Ci分別為第1、2、i-1、i等時間點釋放介質中TA濃度；V1為釋放介質的總體積，V2為取樣體積。

結果見圖5，TA溶液在24h時基本釋放完全，TA-P-NLC在48h內(nèi)累積釋放量僅為45.63%，說明TA-P-NLC中TA的釋放具有明顯的緩釋特性。

圖5 體外釋放曲線

3 討論

包封率是制劑質量評價中最重要的指標之一，藥物和輔料的不同導致包封率的測定方法也千差萬別。本研究曾考慮采用超濾離心法，但進樣分析發(fā)現(xiàn)濾液中并不能檢測到TA。可能是在離心力的作用下，納米粒吸附在濾膜中，游離的TA并不能透過，故檢測不到。使用葡聚糖凝膠微柱離心法分離游離TA，進樣分析結果表明該法能準確地測定包封率，且操作方便、重現(xiàn)性好、誤差較小，故選擇微柱離心法來測包封率。

在TA-P-NLC制備過程中，轉速對實驗結果有顯著影響，轉速較小導致粒徑過大且分布不均勻，轉速較大會產(chǎn)生大量泡沫，導致藥物與輔料之間混合不充分，放置幾天即有絮凝出現(xiàn)；乳化過程決定了整個制劑的成功與否，在水相注入油相時，要控制好注射速度，過快不利于二者的分散融合，過慢由于溫度較高則會使油相因蒸發(fā)而損失。

本實驗選擇磷酸緩沖液(pH7.4)作為釋放介質來模擬體內(nèi)環(huán)境。由于TA難溶于水，故在釋放介質中加入1%的吐溫80以達到漏槽條件。分析體外釋放曲線可知，TA-P-NLC釋放過程可大致分為突釋和緩釋兩部分。前12h左右為突釋過程，累積釋放量約30%，可能是納米粒表面吸附的部分TA快速釋放所致；隨后的釋放過程明顯變慢，一方面可能是納米粒骨架中的藥物隨脂質材料的溶蝕使釋放趨于緩慢，另一方面可能是PEG包裹在納米粒表面，從NLC內(nèi)部釋放出的藥物受到其阻礙而變得緩慢。由于體外釋放數(shù)據(jù)不能代表TA在人體中的釋放過程，所以TA-P-NLC的釋放行為應通過后續(xù)藥動學、藥效學研究進一步證實。

納米藥物遞送系統(tǒng)具有廣闊的發(fā)展前景，尤其在靶向給藥方面極具優(yōu)勢與潛力。本實驗成功制備TA-P-NLC，并對其理化性質進行研究。結果表明，以乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備的TA-P-NLC的粒徑較小且分布均勻、包封率高、體外釋放緩慢，其為丹參酮IIA的臨床應用奠定了基礎。

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