針刺治療慢性心肌缺血小型豬模型系列方法的可行性探討

張金鈴，田 毅，榮培晶*，方繼良，王 瑜，石 力，賈術(shù)永，何 勛， 雷洪濤，孟 宏

(1.中國中醫(yī)科學院針灸研究所，北京 100700； 2.北京協(xié)和醫(yī)學院，中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院，北京 100037； 3.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053； 4.中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心，北京 100700； 5.北京工商大學理學院化妝品系，北京 100048)

“內(nèi)關(guān)”是臨床上首選常用于治療心絞痛、心肌炎、心律不齊等心臟疾病的穴位，大量臨床和小型動物的實驗研究也證實了針刺“內(nèi)關(guān)”療效的作用機理[1]，但針灸“內(nèi)關(guān)”應用于治療大型實驗動物心肌缺血的研究未見報道。大型實驗動物豬的心臟冠狀動脈解剖結(jié)構(gòu)及血流動力學生理病理特點與人類相近，其慢性心肌缺血模型更符合缺血性心肌病的臨床病理生理過程[2]，故本研究擬采用心血管系統(tǒng)與人類更為接近的巴馬小型豬作為實驗動物[3]。通過手術(shù)放置Ameroid縮窄環(huán)于左前降支建立小型豬慢性心肌缺血模型，并采用埋針進行治療[4]，探討該系列方法的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

采用普通級巴馬小型豬12只，雌雄不限，體重18～30 kg，7～8月齡。巴馬小型豬造模后隨機分為治療組針刺內(nèi)關(guān)穴(PC6)和對照組針刺足三里穴(ST36)，每組6只。動物由北京通和生態(tài)比較醫(yī)學研究所動物實驗中心提供 [SCXK (京) 2015-004]，自由飲水，分籠飼養(yǎng)，每天視動物攝食情況補充標準實驗豬飼料，術(shù)前適應性喂養(yǎng)7 d，術(shù)后飼養(yǎng)7周 [SYXK (京) 2014-0014]。動物實驗符合倫理要求，實驗程序通過了中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院實驗動物委員會倫理委員會批準(批號：2013-1-25-973)。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉鹽：Genview分裝，批次號：37H10520；華佗牌針灸針：直徑0.25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品；G3H型多參數(shù)動物監(jiān)護儀：深圳市杰納瑞醫(yī)療儀器有限公司；AM811型麻醉機：北京易世恒電子技術(shù)有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小型豬心肌慢性缺血模型制備[5-7]改良方法

小豬術(shù)前24 h禁食水，采用戊巴比妥鈉進行誘導麻醉，選取耳緣靜脈建立液體通道，吸入異氟烷維持麻醉。小型豬麻醉后，插入氣管內(nèi)導管，呼吸機輔助呼吸，連接心電監(jiān)護儀備用。手術(shù)區(qū)備皮并常規(guī)消毒鋪巾。于左側(cè)第3肋間前外側(cè)作長約8 cm的橫切口入胸并注意止血。在左冠狀動脈左前降支第一對角支分叉處以下約1 cm處放置Ameroid縮窄環(huán)。于左心耳水平處剪開心包并懸吊，于左心耳肺動脈之間尋找左前降支(left anterior descending branch，LAD)主干，小心分離動脈表面的心外膜及脂肪組織，尤其應注意不要損傷小的深穿支以防出血。游離長度約為1.5 cm，小心地將直角鑷挑起游離出的LAD主干兩端，同時，用血管鉗夾持Ameroid環(huán)，使側(cè)口對準冠狀動脈，將LAD迅速套入環(huán)中?？s窄環(huán)植入完畢后，調(diào)整環(huán)的位置，使其位于左心耳與肺動脈之間的溝內(nèi)，同時缺口朝向心包方向，以防縫合心包后壓迫損傷心肌或使縮窄環(huán)脫出。觀察有無出血及縮窄環(huán)位置有無阻礙血流。確認無誤后關(guān)閉心包，膨肺后關(guān)胸。待自主呼吸恢復后，拔除氣管插管，送回動物房。術(shù)后連續(xù)肌注青霉素3 d預防感染，定期觀察切口情況及動物的一般狀態(tài)。

1.3.2 干預方法

心臟慢性缺血造模后4周進行內(nèi)關(guān)和足三里埋針并電針。埋針前提前取出7號埋線針的內(nèi)芯，截取1.5 cm并用砂紙將兩端打磨光滑，將處理好的內(nèi)芯浸泡在75%的酒精中消毒待用。埋針時用鑷子夾取一段處理好的內(nèi)芯，從9號針突孔置在穿刺針套管的前端，從套管尾孔插入一根內(nèi)芯。右手持針柄，左手夾住套管中下段，將7號針芯快速刺入皮下肌層，退出9號針。消毒后紗布包好針孔，防止出血。電針于檢測前預處理，將小型豬麻醉后置于操作臺面監(jiān)控下行針，毫針勻速進針足三里或內(nèi)關(guān)，接通韓式電針儀。

注：A：術(shù)后心臟；B：足三里組；C：內(nèi)關(guān)組。箭頭指示缺血區(qū)域。圖1 術(shù)后心臟大體病理觀察及缺血模型術(shù)后各組的心臟切片形態(tài)改變(TTC染色)Note. A: Heart after operation. B: “Zusanli” (ST36) group.C: “Neiguan” (PC6) group. Arrows indicate the ischemic area.Fig.1 Gross appearance of heart and morphological changes of cardiac sections in each group after modeling of chronic myocardial ischemia. TTC staining

1.3.3 觀察及指標檢測

(1)肉眼大體觀察：取出心臟后大體病理觀察有無缺血的室壁瘤形成，針刺足三里和內(nèi)關(guān)組心臟形態(tài)顏色區(qū)別觀察，拍照。

(2)TTC大體病理染色觀察：方法改良后為預先配制質(zhì)量分數(shù)為1%的TTC磷酸鹽緩沖液于染色缸中，放入恒溫水浴箱恒溫約30 min使達到37℃。取出心臟后快速以垂直心臟長軸的角度，染色切片從左心尖開始，切片到縮窄環(huán)部位，每片厚度1 cm，共計切7片，放入染色缸中染色20 min后依次取出拍照，第一片染色拍照一張，第二至七片各染色拍照兩面兩張，故每只心臟共計染色拍照13張，觀察各切片心肌顏色。

(3)超微結(jié)構(gòu)觀察：取材心臟后隨機選取內(nèi)關(guān)組和足三里組各3例進行超微電鏡取材，每只心臟取缺血區(qū)和非缺血區(qū)各取一塊組織。電鏡方法參照文獻[8]，取材心肌組織黃豆大小，即刻順肌纖維方向切成約1 mm組織塊，4%戊二醛和1%四氧化鋨雙重固定，脫水、包埋、超薄切片70 nm，采用日立H7650透射電鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 小型豬心臟肉眼觀察大體病理改變

摘除心臟后大體觀察結(jié)果如圖1A所示，慢性心肌缺血手術(shù)后，心臟左室靠近室間隔部位可看到明顯的圓形皺褶微紅區(qū)，心臟右側(cè)和右心室前側(cè)暗紅色，可觸摸到心室壁薄變。

2.2 針刺后慢性心肌缺血小型豬心臟TTC病理染色結(jié)果

針刺內(nèi)關(guān)穴后，染色切片前10張基本是暗紅色，還沒有出現(xiàn)明顯的缺血紅色區(qū)。針刺內(nèi)關(guān)穴后的第11～12張染色片出現(xiàn)淡紅色缺血環(huán)區(qū)。針刺后足三里組從第3張染色片以后的各個切片均可見淡紅色化的缺血區(qū)。選取足三里組和內(nèi)關(guān)組典型圖發(fā)現(xiàn)，第11張染色片(1B和1C)顯示缺血出現(xiàn)的鮮紅色中有些許發(fā)白區(qū)域，提示本實驗條件下手術(shù)后出現(xiàn)了缺血區(qū)域，心肌慢性缺血模型成功；循心包經(jīng)針刺內(nèi)關(guān)穴可以減少缺血心肌數(shù)量，對缺血心肌的保護效應強于足三里穴的效應。

2.3 電鏡透射掃描心肌細胞超微結(jié)構(gòu)改變結(jié)果

如圖2A所示，正常豬心肌細胞電鏡圖可見線粒體嵴排列整齊、密集，線粒體膜完整，空泡化線粒體少見，肌絲排列整齊致密。針刺足三里心肌細胞(如圖2B所示)線粒體出現(xiàn)空泡化，嵴消失，有些線粒體缺失，結(jié)構(gòu)不清，心肌纖維化明顯。針刺內(nèi)關(guān)組缺血區(qū)心肌細胞電鏡圖(圖2C)顯示，散在的線粒體內(nèi)部嵴消失，部分線粒體缺如，肌絲結(jié)構(gòu)不清，纖維化明顯，和足三里組比較無明顯差異。

注：A：正常心肌；B：足三里組缺血區(qū)心肌；C：內(nèi)關(guān)組缺血區(qū)心肌。圖2 缺血造模術(shù)后各組心肌細胞的超微結(jié)構(gòu)比較(× 30 000)Note. A: Normal myocardium. B: “Zusanli’ (ST36) group. C: “Neiguan” (PC6) group.Fig.2 Comparison of ultrastructure of the cardiomyocytes in each group after operation for modeling of chronic myocardial ischemia

3 討論

缺血性心肌病是目前人類死亡率越來越高的疾病，據(jù)統(tǒng)計缺血性心臟病、中風和慢性阻塞性肺疾病占全球約32%的死亡原因，而缺血性心臟病位居第一[9-10]。研究表明，電針心包經(jīng)“內(nèi)關(guān)”-“間使”可通過改善交感、迷走活動的平衡實現(xiàn)降低血清心肌酶及內(nèi)皮素的水平來減輕缺血性心肌損傷[11]，但都是采用小型實驗動物大鼠、小鼠，本研究的慢性心肌缺血模型是冠狀動脈漸進性阻塞逐漸發(fā)展到心肌缺血狀態(tài)而引起病變，這種大型實驗動物的慢性模型更符合臨床疾病生理病理過程。實驗豬的心臟冠狀動脈解剖結(jié)構(gòu)及側(cè)枝循環(huán)與人類相似，心肌有相對較多的冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)，造模后存活率高，豬的慢性心肌缺血模型可為研究針刺預防和治療心肌缺血、冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)生成等提供條件[12-16]。本研究埋針并電針的療法應用于與人類更為相近的大型實驗動物心肌缺血模型豬的設(shè)計尚屬首創(chuàng)。

大體病理在臨床上通常是診斷的金標準，本研究心臟的大體病理染色采用氯化三苯基四氮唑(TTC)，是一種脂溶性光敏感復合物，常用作染色劑檢測哺乳動物組織的缺血梗塞，正常組織表現(xiàn)為暗紅色，它與組織中脫氫酶反應后，缺血組織表現(xiàn)鮮紅色或淡紅色，但梗死組織中脫氫酶活性下降不能與其反應，故不被染色呈蒼白色[17]。本研究針刺“內(nèi)關(guān)”后TTC病理染色結(jié)果顯示，第11張染色片始有缺血紅色區(qū)可見。針刺“足三里”穴第3張染色片就隱約可見淡紅色的缺血區(qū)。手術(shù)后均出現(xiàn)TTC染色病理切片鮮紅色缺血區(qū)，說明此種手術(shù)放置縮窄環(huán)造模慢性心肌缺血方法成功，同時比較此兩例顯示治療組針刺“內(nèi)關(guān)”穴對缺血的抑制效應強于對照組針刺“足三里”穴。

線粒體具有為細胞提供能量、參與細胞分化、細胞信息傳遞等一系列細胞代謝離子通道的功能，它的損傷是很多疾病產(chǎn)生的根源，故線粒體的保護機制的研究顯現(xiàn)出越發(fā)重要的作用。線粒體腫脹、形態(tài)改變是線粒體損傷的重要特征[18]，透射電鏡可以直觀地觀察到線粒體嵴斷裂消失減少、線粒體腫脹等損傷狀況。本實驗透射電鏡觀察線粒體損傷程度發(fā)現(xiàn)慢性心肌缺血造模手術(shù)后針刺“足三里”和“內(nèi)關(guān)”穴心肌細胞均出現(xiàn)線粒體空泡化，嵴消失，有些線粒體缺失，看不到肌絲，結(jié)構(gòu)不清，纖維化明顯。說明手術(shù)后導致了心肌細胞線粒體的損傷模型成功，針刺心包經(jīng)穴位“內(nèi)關(guān)”沒有表現(xiàn)出比“足三里”更好的抑制線粒體超微結(jié)構(gòu)變異的效應。

本研究結(jié)果可見針刺“內(nèi)關(guān)”可以減少慢性心肌缺血的面積，提示針刺心包經(jīng)“內(nèi)關(guān)”穴可以通過減少心肌細胞缺血損傷數(shù)量的途徑來起到保護心肌的效應，而不能抑制已經(jīng)造成缺血損傷細胞的線粒體變異的程度。

小型豬的生理特性與人類最為接近，且對缺血性損傷敏感。以往慢性缺血模型多采用冠脈結(jié)扎、藥物、球囊等方式，病程較急，死亡率高。故本實驗探索采用巴馬小型豬冠狀動脈前降支放置縮窄環(huán)的方法，雖然需要操作人員的精湛技術(shù)，但成模率能達到大約80%，缺血梗死面積基本可控，模型動物存活時間長，利于實施慢性針灸效應和不同方式強度電針效應觀察，重要的是這種可用于針灸療效研究的模型與人類慢性心肌缺血疾病的發(fā)生發(fā)展的病理生理過程相似度高。

本研究說明手術(shù)放置Ameroid縮窄環(huán)于左前降支建立小型豬慢性心肌缺血模型，并采用埋針進行治療的系列創(chuàng)新方法是可行的，實現(xiàn)了將傳統(tǒng)醫(yī)學的精華埋針并電針治療方法應用于大型實驗動物模型研究的跨越。

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