電針預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響①

葉濤，朱路文，唐強(qiáng)，李宏玉，吳孝軍，陳晨，姜云飛，李佳帥

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001

全球每年約有1500萬人患有腦卒中，約有500萬人死亡，是造成死亡的第二大病因，也是長期殘疾的主要原因，其中缺血性腦卒中約占所有病例的80%[1]。目前臨床上急性缺血性腦卒中的標(biāo)準(zhǔn)治療是采用組織纖溶酶原激活物進(jìn)行溶栓誘導(dǎo)再灌注，但由于其時間窗非常窄，極易造成腦缺血再灌注損傷的發(fā)生[2]。研究顯示[3-5]，細(xì)胞凋亡在腦缺血再灌注引起的二次損傷中發(fā)揮重要作用，與腦梗死體積的大小密切相關(guān)，p53、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X Protein,Bax)是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)。電針預(yù)處理，即缺血前給予單次或重復(fù)多次的電針干預(yù)，可以誘導(dǎo)腦缺血耐受，減輕缺血再灌注后腦損傷程度，發(fā)揮腦保護(hù)作用[6]。與其他預(yù)處理方式比較，電針更加簡便易行，臨床可操作性強(qiáng)。我們前期研究顯示[6-7]，針刺時程是電針預(yù)處理腦保護(hù)作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素之一，電針多次重復(fù)預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的效果優(yōu)于單次預(yù)處理，且重復(fù)預(yù)處理時間越長效果越好。

為了更好貼合臨床住院治療時間，建立缺血性腦卒中二級預(yù)防的電針預(yù)處理方案，我們選擇每周5～6 d，連續(xù)2周的治療方案，其腦保護(hù)作用在多次基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[8-10]。本研究觀察其對腦缺血再灌注大鼠腦缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、Bcl-2表達(dá)的作用，擬從抗凋亡角度，探討電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

SPF級Sprague-Dawley大鼠，雄性，8～10周齡，初始體質(zhì)量220～240 g，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(遼)2015-0001。大鼠飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級屏障系統(tǒng)，動物自由食水。溫度23～25℃，濕度60%～70%，人工光照12 h∶12 h明暗交替。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)管理委員會批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)大鼠的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室目前大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型成功率(80%以上)和術(shù)后1 d死亡率(10%左右)，考慮本實(shí)驗(yàn)每組最終需要18只大鼠，規(guī)定本實(shí)驗(yàn)的樣本量為72只。將72只大鼠編號，選擇數(shù)字表中的最大數(shù)對應(yīng)大鼠編號1，依次從左至右，分別對應(yīng)1～72號大鼠。用隨機(jī)數(shù)字除以3得余數(shù)0、1、2，余數(shù)為0的對應(yīng)假手術(shù)組，余數(shù)為1對應(yīng)模型組，余數(shù)為2對應(yīng)電針預(yù)處理組，最終各組分得24只大鼠。取材時假手術(shù)組無淘汰，模型組因造模失敗與評分不合格各淘汰1只，電針預(yù)處理組因評分不合格淘汰2只，最終各組隨機(jī)取18只，多余大鼠用于其他研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑

G6805-2A型低頻脈沖電針儀：上海華誼公司。一次性無菌針灸針：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。Multiskan FC型酶標(biāo)儀、微量移液器：美國THERMOSCIENTIFIC公司。RM2235型切片機(jī)：德國LEICA公司。H-2050R超速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀公司。WD-9405B型水平搖床、DYCZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽：北京六一生物科技有限公司。

p53、Bax、Bcl-2、內(nèi)參抗體 β-actin、羊抗兔IgG-HRP、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光液：沈陽WANLEIBIO公司。TEMED：美國AMRESCO公司。PVDF膜：美國MILLIPORE公司。預(yù)染蛋白Marker：加拿大FERMENTAS公司。TTC粉：北京索萊寶科技有限公司。TUNEL試劑盒：德國ROCHE公司。

1.3 模型建立

大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水。2%戊巴比妥鈉3 ml/kg腹腔注射麻醉后，參照改良Longa法制備大鼠MCAO再灌注模型。頸部正中切口，于右側(cè)胸鎖乳突肌與二腹肌前頭之間暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈。結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈，暫時夾閉頸內(nèi)動脈，用7號針頭在頸總動脈距血管分叉1 cm處刺一小口，將用石蠟包被過頭端的魚線(直徑0.26 mm)經(jīng)頸總動脈送入頸內(nèi)動脈，插入深度約18～22 mm，直達(dá)大腦中動脈起始處。2 h后拔出栓線。再灌注2 h后行大鼠行為學(xué)評分，Longa評分2～3分的納入研究。

假手術(shù)組大鼠僅接受類似模型組的各項(xiàng)手術(shù)操作，不插入線栓。

1.4 電針預(yù)處理[9]

造模前2周，電針預(yù)處理組每次電針前腹腔注射2%戊巴比妥鈉3 ml/kg麻醉大鼠，恒溫加熱板維持體溫37～39℃。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》定位百會穴，采用直徑0.25 mm，長25 mm針灸針向鼻尖方向平刺約5 mm。接G6805-2A型電針儀，正負(fù)極分別接大鼠右耳根部和針柄，疏密波，頻率2/15 Hz，強(qiáng)度以右耳出現(xiàn)輕微震顫為度，持續(xù)刺激30 min。電針間隔24 h，每6天休息1 d。共2周。

假手術(shù)組、模型組接受相同的麻醉操作，但不進(jìn)行電針干預(yù)。

整個預(yù)處理過程保證周圍環(huán)境安靜，電針結(jié)束后放回籠待其自行蘇醒。

1.5 改良神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評分(modified Neurologic Severity Score,mNSS)[11]

再灌注24 h后，各組大鼠行mNSS評分，分別從運(yùn)動、感覺、反射三個方面對大鼠的神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評估?？偡?4分，1～4分為輕度缺損，5～9分為中度缺損，10～14分為重度缺損。

1.6 取材

完成mNSS評分后，大鼠2%戊巴比妥鈉4～5 ml/kg腹腔注射深度麻醉。取6只斷頭取腦行TTC染色；6只用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液心內(nèi)灌注后，切取缺血半暗區(qū)組織，常規(guī)制備厚5μm石蠟薄片，行TUNEL染色；6只冰板上快速斷頭取腦，切取缺血半暗區(qū)組織，液氮凍存，待Western blotting檢測。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 腦梗死體積[12]

腦組織置-20℃冰箱內(nèi)速凍15～20 min后取出。間隔2 mm冠狀連續(xù)切取6個腦片，2%TTC PBS溶液37℃孵育15～20 min。平攤腦片于黑色背景上，旁邊放置一把卡尺，數(shù)碼相機(jī)拍照。Image-Pro Plus 6.0計算腦片的梗死面積與全腦面積百分比，取均數(shù)。

1.7.2 凋亡細(xì)胞計數(shù)

石蠟切片60℃烘烤2 h，二甲苯脫蠟兩次，每次15 min，下行乙醇溶液水合，室溫下蛋白酶K消化30 min，PBS漂洗3次，每次5 min(下同)，37℃暗濕盒中滴加TUNEL反應(yīng)液50μl孵育1 h，PBS漂洗；37℃暗濕盒中滴加POD反應(yīng)液50μl孵育30 min，PBS漂洗。室溫下DAB顯色，PBS漂洗，蘇木素復(fù)染，溫水返藍(lán)。上行乙醇溶液脫水，二甲苯透明，封片。每只大鼠選1張切片，10×10倍鏡下定位腦梗死灶周邊區(qū)頂葉皮質(zhì)陽性表達(dá)“熱點(diǎn)區(qū)”，10×40倍鏡下觀察不重疊3個視野并拍照。采用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，取3個視野下的均值。

1.7.3 Western blotting

取腦組織樣本稱重，按加入蛋白裂解液5 ml/g制成蛋白勻漿，低溫孵育后收集上清。BCA法測定總蛋白濃度。上樣體積20μl，含蛋白40μg。SDS-PAGE電泳80 V、2.5 h分離目的蛋白，80V、1.5 h轉(zhuǎn)到PVDF膜。室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入p53(1∶500)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)一抗，4 ℃孵育過夜。搖床搖動TBST洗膜4次，每次5 min；加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5000)，37℃孵育45 min。搖床搖動TBST洗膜6次，每次5 min。加入ECL底物發(fā)光液，室溫靜置5 min，保鮮膜覆蓋，玻棒去除多余水分，暗室曝光顯影。掃描后，采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。以假手術(shù)組某一樣本蛋白表達(dá)量為1，其余樣本均為與其較正后的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 mNSS

假手術(shù)組大鼠mNSS評分均為0。模型組mNSS評分較假手術(shù)組升高(P＜0.05)，電針預(yù)處理組mNSS評分較模型組降低(P＜0.05)。見表1。

2.2 凋亡細(xì)胞計數(shù)

假手術(shù)組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞極少。模型組TUNEL陽性細(xì)胞較假手術(shù)組增多(P＜0.05)，電針預(yù)處理組TUNEL陽性細(xì)胞較模型組減少(P＜0.05)。見表2、圖1。

2.3 Western blotting

假手術(shù)組p53、Bax、Bcl-2蛋白基礎(chǔ)表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組p53、Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白降低，Bax/Bcl-2比升高(均P＜0.05)；與模型組比較，電針預(yù)處理組p53、Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax/Bcl-2比降低(P＜0.05)。見表2、圖2。

2.4 腦梗死體積

假手術(shù)組未出現(xiàn)腦梗死。模型組腦梗死百分比較假手術(shù)組增加(P＜0.05)，電針預(yù)處理組腦梗死百分比較模型組減小(P＜0.05)。見表2、圖3。

表1 各組大鼠mNSS評分比較

表2 各組大鼠各檢測指標(biāo)比較

圖1 各組TUNEL陽性細(xì)胞(TUNEL染色，bar=50μm)

圖2 各組Western blotting檢測結(jié)果

圖3 各組大鼠腦梗死體積(TTC染色)

3 討論

缺血性腦卒中屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，多因風(fēng)、火、痰、瘀等病邪上擾清竅，而致“竅閉神匿，神不導(dǎo)氣”所致，治療當(dāng)遵循“病變在腦，首取督脈”的理論。百會穴屬督脈，為百脈之會，百病所主，有通絡(luò)理氣、升陽益氣、熄風(fēng)開竅、醒腦利竅等功效[13]。國內(nèi)外研究證實(shí)[7-8,10,14-19]，重復(fù)電針預(yù)處理百會穴可誘導(dǎo)腦缺血耐受，降低腦缺血再灌注損傷程度，發(fā)揮腦保護(hù)作用，機(jī)制與降低炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增強(qiáng)細(xì)胞自噬，促進(jìn)細(xì)胞存活與增殖等有關(guān)，涉及多水平、多通路、多靶點(diǎn)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

細(xì)胞凋亡是多基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡，再灌注引起的遲發(fā)型神經(jīng)細(xì)胞死亡多以細(xì)胞凋亡為主，主要發(fā)生在缺血中心區(qū)周圍的半暗區(qū)，腦損傷的嚴(yán)重程度、腦梗死體積的大小與其密切相關(guān)[20]。如何精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞凋亡，挽救缺血半暗區(qū)細(xì)胞成為減輕腦缺血損傷程度的重要靶點(diǎn)。本研究顯示，腦缺血再灌注后，缺血半暗區(qū)大量神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡；電針預(yù)處理干預(yù)可降低細(xì)胞凋亡水平，縮小腦梗死體積，改善神經(jīng)功能，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

本課題組前期已經(jīng)證實(shí)[8-9,12]，電針預(yù)處理的抗凋亡作用與下調(diào)缺血半暗區(qū)Toll樣受體-4、核轉(zhuǎn)錄因子-κB蛋白表達(dá)，抑制血清與腦組織中白介素-1β、白介素-6介導(dǎo)的炎性損傷有關(guān)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

腫瘤抑制基因p53是細(xì)胞生存和死亡的重要調(diào)制器，抑制其表達(dá)可作為缺血性腦卒中的治療手段[3,21]。p53作為調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，通過調(diào)控其下游相關(guān)通路靶蛋白發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡功能。正常組織中表達(dá)量極低，主要通過轉(zhuǎn)錄依賴機(jī)制及轉(zhuǎn)錄非依賴機(jī)制兩種途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡。除促進(jìn)細(xì)胞凋亡外，p53還具有調(diào)控細(xì)胞增殖、自噬、再生修復(fù)、細(xì)胞生長分化等作用[22-24]。

Bcl-2家族主要參與細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑，其作用貫穿腦缺血再灌注損傷始終[25]。Bcl-2是Bcl-2家族成員之一，是公認(rèn)的抑制細(xì)胞凋亡基因，能夠抑制細(xì)胞凋亡但不影響細(xì)胞增殖。Bcl-2是一種與線粒體相關(guān)的膜穩(wěn)定蛋白，能夠維持和保護(hù)膜的穩(wěn)定性，抑制自由基產(chǎn)生，維持細(xì)胞核內(nèi)鈣離子濃度，抑制caspase活化和與Bax形成異源二聚體等，抑制細(xì)胞凋亡早期階段[26-27]。腦缺血可促進(jìn)p53表達(dá)，p53能抑制Bcl-2表達(dá)，同時促進(jìn)Bax表達(dá)，上調(diào)Bax/Bcl-2比，進(jìn)而調(diào)控caspase促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加重腦損傷[28-30]。電針干預(yù)可下調(diào)大腦皮層、海馬Bax/Bcl-2比，使抗凋亡基因占據(jù)優(yōu)勢，抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡，減輕腦水腫，改善神經(jīng)功能缺損[20,31]。

本研究顯示，腦缺血再灌注損傷后缺血半暗區(qū)p53、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，與既往結(jié)果保持一致。電針預(yù)處理一方面可以抑制促凋亡基因p53、Bax表達(dá)上調(diào)，另一方面又可促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2進(jìn)一步表達(dá)，下調(diào)Bax/Bcl-2比，從而降低細(xì)胞凋亡水平，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

本研究尚不能證明電針預(yù)處理抑制p53表達(dá)與下調(diào)Bax/Bcl-2比直接相關(guān)，且僅從抗凋亡角度探討了p53在電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受中的作用機(jī)制。下一步我們將應(yīng)用p53抑制劑和激動劑對p53介導(dǎo)的凋亡、自噬、細(xì)胞增殖途徑展開深入研究，并探討電針預(yù)處理在其中所發(fā)揮的作用，豐富其腦保護(hù)作用機(jī)制。

近年來，多項(xiàng)電針預(yù)處理的臨床應(yīng)用研究證實(shí)，其在心、腦損傷方面具有保護(hù)作用，有很好的臨床應(yīng)用前景[32-34]。我們將設(shè)計缺血性腦卒中電針預(yù)處理方案，以降低再次卒中的發(fā)病率和致殘率。

[1]Murray CJ,Lopez AD.Measuring the global burden of disease[J].N Engl JMed,2013,369(5):448-457.

[2]Ansar S,Chatzikonstantinou E,Thiagarajah R,et al.Pro-inflammatory mediators and apoptosis correlate to rt-PA response in a novel mouse model of thromboembolic stroke[J].PLoS One,2014,9(1):e85849.

[3]Kizmazoglu C,Aydin HE,Sevin IE,et al.Neuroprotective effect of resveratrol on acute brain ischemia reperfusion injury by measuring annexin V,p53,Bcl-2 levels in rats[J].JKorean Neurosurg Soc,2015,58(6):508-512.

[4]Zhang J,Xia Y,Xu Z,et al.Propofol suppressed hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in HBVSMC by regulation of the expression of Bcl-2,Bax,Caspase3,Kir6.1,and p-JNK[J].Oxid Med Cell Longev,2016,2016:1518738.

[5]Lu H,Wang B.SIRT1 exerts neuroprotective effects by attenuating cerebral ischemia/reperfusion-induced injury via targeting p53/microRNA-22[J].Int J Mol Med,2017,39(1):208-216.

[6]葉濤,朱路文,唐強(qiáng).電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的研究進(jìn)展[J].針灸臨床雜志,2015,31(2):87-90.

[7]林咸明,陳麗萍,姚旭.不同時程電針預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障基質(zhì)金屬蛋白酶-9,血管內(nèi)皮生長因子的影響[J].針刺研究,2015,40(1):40-44.

[8]朱路文,葉濤,姜云飛,等.電針預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后炎性因子及細(xì)胞凋亡的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2016,22(7):765-768.

[9]葉濤,朱路文,唐強(qiáng),等.電針預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能和缺血半暗區(qū)Tolls樣受體4、核轉(zhuǎn)錄因子κB蛋白的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(7):745-749.

[10]葉濤,朱路文,唐強(qiáng),等.電針預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積及血清TNF-α、IL-10含量的影響[J].中國針灸,2017,37(10):1093-1098.

[11]唐強(qiáng),葉濤,朱路文,等.針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號通路的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(1):27-31.

[12]Zhu L,Ye T,Tang Q,et al.Exercise preconditioning regulates the Toll-like receptor 4/nuclear factor-κb signaling pathway and reduces cerebral ischemia/reperfusion inflammatory injury:a study in rats[J].JStroke Cerebrovasc Dis,2016,25(11):2770-2779.

[13]程為平,韋燕博,張茜茹.論百會穴穴性及臨床應(yīng)用[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,17(3):5-6.

[14]He X,Mo Y,Geng W,et al.Role of Wnt/β-catenin in the tolerance to focal cerebral ischemia induced by electroacupuncture pretreatment[J].Neurochem Int,2016,97:124-132.

[15]Jung YS,Lee SW,Park JH,et al.Electroacupuncture preconditioning reduces ROSgeneration with NOX4 down-regulation and ameliorates blood-brain barrier disruption after ischemic stroke[J].JBiomed Sci,2016,23:32.

[16]Ran QQ,Chen HL,Liu YL,et al.Electroacupuncture preconditioning attenuates ischemic brain injury by activation of the adenosine monophosphate-activated protein kinase signaling pathway[J].Neural Regen Res,2015,10(7):1069-1075.

[17]Wu ZQ,Cui S,Zhu L,et al.Study on the mechanism of mTOR-mediated autophagy during electroacupuncture pretreatment against cerebral ischemic injury[J].Evid Based Complement Alternat Med,2016,2016:9121597.

[18]陳懷龍,齊慧,劉孝潔,等.電針預(yù)處理對全腦缺血再灌注損傷大鼠海馬葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78和生長停滯及DNA損傷基因153表達(dá)的影響[J].針刺研究,2014,39(6):431-436.

[19]張業(yè)貴,龔鑫,侯良芹.電針預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)一氧化氮合酶及膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響[J].針刺研究,2015,40(2):113-118.

[20]張業(yè)貴,龔鑫,李懷斌.電針對腦缺血再灌注大鼠額葉皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)Bcl-2,Bax表達(dá)的影響[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,33(2):95-98.

[21]Balaganapathy P,Baik SH,Mallilankaraman K,et al.Interplay between Notch and p53 promotes neuronal cell death in ischemic stroke[J].J Cereb Blood Flow Metab,2017.[Epub ahead of print].doi:10.1177/0271678X17715956.

[22]范瑞娟,羅亞非,陳永順,等.桃紅四物湯對大鼠腦缺血再灌注損傷后大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Caspase-3與p53表達(dá)的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2015,31(6):739-745.

[23]Li T,Liu X,Jiang L,et al.Loss of p53-mediated cell-cycle arrest,senescence and apoptosis promotes genomic instability and premature aging[J].Oncotarget,2016,7(11):11838-11849.[24]Zhang P,Lei X,Sun Y,et al.Regenerative repair of Pifithrin-α in cerebral ischemia via VEGF dependent manner[J].Sci Rep,2016,6:26295.

[25]沈梅紅,劉曉華,李纓,等.電針調(diào)節(jié)腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)[J].遼寧中醫(yī)雜志,2012,39(1):155-157.

[26]卜淵,張培影,耿德勤,等.電針?biāo)幯鯇Υ笫笕X缺血再灌注后Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響[J].針刺研究,2010,35(3):208-212.

[27]陳鋒,嚴(yán)志康,楊波.頭皮針對腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)腦組織bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)以及血液流變的影響[J].針刺研究,2009,34(6):363-367.

[28]顏玲,黃德彬,劉錦紅,等.黃芪多糖對腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)中HSP70、PKB和P53蛋白表達(dá)的影響[J].中國病理生理雜志,2012,28(9):1610-1617.

[29]吳孝軍,葉濤,李宏玉,等.運(yùn)動預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白P53表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2016,22(10):1117-1120.

[30]Liu QS,Deng R,Li S,et al.Ellagic acid protects against neuron damage in ischemic stroke through regulating the ratio of Bcl-2/Bax expression[J].Appl Physiol Nutr Metab,2017,42(8):855-860.

[31]范茜茜,董勤,沈梅紅,等.電針對大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響[J].中國老年學(xué),2017,37(5):1041-1043.

[32]Lu ZH,Bai XG,Xiong LZ,et al.Effect of electroacupuncture preconditioning on serum S100βand NSE in patients undergoing craniocerebral tumor resection[J].Chin J Integr Med,2010,16(3):229-233.

[33]Yang L,Yang J,Wang Q,et al.Cardioprotective effects of electroacupuncture pretreatment on patients undergoing heart valve replacement surgery:a randomized controlled trial[J].Ann Thorac Surg,2010,89(3):781-786.

[34]Wang Q,Liang D,Wang F,et al.Efficacy of electroacupuncture pretreatment for myocardial injury in patients undergoing percutaneous coronary intervention:a randomized clinical trial with a 2-year follow-up[J].Int JCardiol,2015,194:28-35.