不同電針法對APP/PS1小鼠海馬高遷移率族蛋白B1和白細胞介素-10表達的影響①

趙江豪，姚海江，王遠征，盧夢晗，李昱頡，宋萌，楊利娟，劉俊彤，李志剛

1.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，北京市100029；2.中國康復研究中心北京博愛醫(yī)院中醫(yī)治療中心，北京市100068；3.首都醫(yī)科大學康復醫(yī)學院，北京市100068；4.北京大學第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，北京市100084

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)也稱“老年性癡呆”，起病隱匿，以老年人(包括老年前期)為多發(fā)人群，是一種以認知、記憶能力持續(xù)受損和人格改變等為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)退行性疾病[1]。AD是癡呆發(fā)病的最主要類型，在中國可占全部癡呆人群的50%～70%[2]。慢性炎癥反應是AD發(fā)病過程中的重要病理表現(xiàn)之一[3-4]。小膠質(zhì)細胞(microglia,MG)作為CNS的天然屏障，是重要的免疫細胞，在AD的病理發(fā)展過程中起著推波助瀾的重要作用：MG的過度活化，可釋放大量致炎蛋白因子，介導神經(jīng)炎癥反應，促使神經(jīng)元持續(xù)受損[5-6]。非甾體類消炎鎮(zhèn)痛藥可降低AD的風險，減緩疾病進展，進一步佐證炎癥反應與AD發(fā)病之間存在著密切關系[7-8]。

大量研究證實[9-10]，電針對AD有效。本研究從MG活化角度出發(fā)，選取與AD反應密切相關的高遷移率族蛋白B1(high mobility group box protein-1,HMGB1)、白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)，探討分析不同電針在“通督啟神”針法下對AD治療效果的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

7月齡SPF級健康雄性黑色雙轉(zhuǎn)基因APP/PS1小鼠32只，購于南京大學南京生物醫(yī)藥研究院模式動物研究所，批準號SCXK(寧)2010-0001，體質(zhì)量(24.6±4.3)g。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物中心屏障系統(tǒng)單籠。根據(jù)小鼠體質(zhì)量標號，隨機數(shù)字表法分為模型組、藥物組、脈沖電針組及音樂電針組各8只；選擇8只同月齡相同背景的C57BL/6小鼠作為正常對照組。

1.2 主要試劑與儀器

ZYTH2013030504無菌針灸針，直徑0.25 mm、長13 mm：北京中研太和醫(yī)療器械有限公司。ZJ-12H音樂電針治療儀：深圳市圣祥高科技有限公司。HANS-202型韓式電針儀：南京濟生醫(yī)療科技有限公司。XR-XM101型Morris水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統(tǒng)：上海欣軟信息科技公司。自制小鼠束縛套，約8×4 cm，頭部用雙層紗布縫制。電泳儀：美國BIO-RAD公司。離心機：美國THERMO公司。BX53光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司。石蠟切片機：德國LEICA公司。

二甲苯(分析純)：北京化學試劑公司。兔抗HMGB1多克隆抗體、大鼠抗IL-10單克隆抗體：英國ABCAM公司。

1.3 方法

脈沖電針組小鼠用束縛套固定，參照實驗動物針灸穴位圖譜，交叉平刺百會、印堂，兩針針體不接觸，以防短路，深約0.5 cm，針柄接韓式電針儀，頻率2 Hz，強度以小鼠頭部稍稍顫動為宜，每次20 min，后點刺人中。每天上午9:00治療1次，共15 d。

音樂電針組小鼠同法束縛、針刺，選取節(jié)奏明朗的癡呆處方干預，以小鼠保持安靜不暴躁掙扎為度。

藥物組予鹽酸多奈哌齊0.92 mg/kg灌胃給藥。

正常對照組、藥物組和模型組同法抓取并用相同鼠套束縛20 min。

1.4 Morris水迷宮檢測

Morris水迷宮水深約29 cm，水溫(22±2)℃，加入低糖低脂奶粉使水成為半透明乳白色，以利于攝像分辨為度。水池內(nèi)水面平均分為4個象限，平臺放置于第三象限中央，水面下1 cm。水池上方裝備攝像機，將所采集信號傳入計算機分析軟件系統(tǒng)，進行圖像和數(shù)據(jù)自動采集和處理。

1.4.1 定位航行實驗

在水迷宮實驗前一天，撤離平臺，小鼠在水池內(nèi)游泳訓練90 s。正式實驗時，小鼠入水前先將其放在平臺上10 s令其熟悉環(huán)境；以第一象限池壁中央為入水點，面朝池壁放入水中。小鼠登臺停留5 s，自動記錄逃避潛伏期；若90 s內(nèi)小鼠未能登上平臺，則逃避潛伏時記為90 s。共測試5 d。

1.4.2 空間探索實驗

定位航行實驗結(jié)束后，拆除平臺，將小鼠分別從第一、二、四象限池壁中點相同方法放入池中，記錄90 s內(nèi)小鼠在原平臺所在象限的游泳時間與游泳總時間之比。

1.5 HMGB1與IL-10檢測

1.5.1 Western blotting

水迷宮測試完畢后，各組隨機取4只小鼠，10%水合氯醛0.01 ml/g腹腔注射麻醉，斷頭處死，取出腦組織，冰袋上分離出大腦海馬，存置于滅菌凍存管。將液氮中組織取出，加入蛋白裂解液，測定蛋白含量，取樣本30μg，10%SDS-PAGE電泳，半干電轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%TBS-T脫脂奶粉封閉震蕩60 min，加入 HMGB1 抗體(1∶100)或 IL-10 抗體(1∶2000)4℃孵育過夜。第2天洗膜，加二抗(HMGB1 1∶100，IL-10 1∶2000)37℃震蕩孵育1 h；加發(fā)光液，曝光后顯影清晰時漂洗定影，晾干掃描。用Image-Pro Plus軟件對目的條帶進行灰度分析，以目的蛋白與β-actin的相對灰度值表示。

1.5.2 免疫組化染色

將其余4只小鼠10%水合氯醛0.01 ml/g腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，左心尖插入針頭固定，剪開右心耳，以生理鹽水灌注至流出液體清亮，肝臟灰白色；換4%多聚甲醛繼續(xù)灌注至小鼠軀干、四肢及尾部全部僵硬，取全腦，置4%多聚甲醛中，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片。切片脫蠟，枸椽酸水煮抗原修復10 min，PBS漂洗3遍。3%H2O2常溫保濕盒中10 min，PBS漂洗；正常非免疫羊血清室溫保濕盒中孵育10 min；加兔抗HMGB1多克隆抗體(1∶1100)或鼠抗IL-10單克隆抗體(1∶50)，4℃冰箱孵育過夜；第2天PBS漂洗，HMGB1使用生物素標記的羊抗兔IgG二抗，IL-10使用生物素標記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育10 min，PBS漂洗；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶37℃孵育10 min，PBS漂洗；DAB顯色，顯微鏡下觀察并適時終止顯色；蘇木素復染(HMGB1不復染)，酒精梯度脫水，中性樹脂封片。以海馬CA1部分為圖片分析區(qū)域，每組取相互不重疊的6個視野，Image-Pro Plus軟件分析系統(tǒng)計數(shù)陽性細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行處理。各數(shù)據(jù)均以(xˉ±s)表示，水迷宮逃避潛伏期采用重復測量方差分析，水迷宮空間探索測試實驗和Western blotting數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用單因素方差分析，組間比較選用LSD檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

定位航行實驗隨著訓練時間增加，各組逃避潛伏期呈下降趨勢。與正常對照組比較，模型組逃避潛伏期較長(P＜0.05)。前兩天藥物組、脈沖電針組和音樂電針組均與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，第3天音樂電針組與模型組有顯著性差異(P＜0.05)，第4天以后正常對照組、藥物組、脈沖電針組、音樂電針組與模型組均有顯著性差異(P＜0.05)，正常對照組逃避潛伏期最短，其次是音樂電針組、脈沖電針組、藥物組，模型組最長。見表1。

空間探索實驗中，正常對照組目標象限游泳時間比值最高，而后依次是音樂電針組、脈沖電針組、藥物組，模型組最低。音樂電針組與脈沖電針組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表1 各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較(s)

表2 各組目標象限游泳時間與總時間之比的比較

2.2 Western blotting

與正常對照組比較，模型組HMGB1蛋白表達增加(P＜0.05)；與模型組相比，脈沖電針組和音樂電針組的蛋白表達下降(P＜0.05)；音樂電針組比脈沖電針組無顯著性差異(P＞0.05)。見表3、圖1。

與正常對照組比較，模型組IL-10蛋白減少(P＜0.05)；與模型組相比，脈沖電針組和音樂電針組的IL-10蛋白表達上升(P＜0.05)；音樂電針組比脈沖電針組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組海馬IL-10表達(Western blotting)

2.3 免疫組化染色

正常對照組小鼠海馬CA1區(qū)HMGB1陽性細胞表達數(shù)量最少(P＜0.001)，模型組相同腦區(qū)表達最多，主要表達于胞漿和胞外。與模型組比較，脈沖電針組和音樂電針組HMGB1陽性細胞表達下降(P＜0.05)，音樂電針組表達少于脈沖電針組(P＜0.05)。見表4、圖3。

正常對照組小鼠海馬CA1區(qū)IL-10表達最多，模型組表達最少(P＜0.001)，主要為胞質(zhì)，胞核少量著色。與模型組比較，脈沖電針組和音樂電針組IL-10表達增多(P＜0.05)，音樂電針組表達多于脈沖電針組(P＜0.05)。見表4、圖4。

表3 各組海馬HMGB1與IL-10表達比較

表4 各組海馬HMGB1與IL-10陽性細胞數(shù)比較

圖3 各組海馬HMGB1表達(免疫組化染色,bar=50μm)

圖4 各組海馬IL-10表達(免疫組化染色,bar=50μm)

3 討論

研究顯示，由于β淀粉樣蛋白(betaamyloid,Aβ)沉積引發(fā)MG過度活化，其誘發(fā)的神經(jīng)炎癥反應在AD神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮重要作用，可能是AD的發(fā)病機制之一[11-12]。MG作為CNS的免疫細胞，具有“雙刃劍”效應，既可以監(jiān)測腦內(nèi)微環(huán)境，抵抗各種損傷，發(fā)揮吞噬凋亡細胞碎片的作用；又可誘導、加重CNS炎癥反應，從而加速AD發(fā)展，加劇神經(jīng)元破壞和凋亡[13]。MG可在Aβ沉積以及Tau磷酸化等的刺激下，呈M1型極化，胞體發(fā)生阿米巴樣形態(tài)轉(zhuǎn)化，正常吞噬功能減弱，分泌大量致炎因子。MG還具有拮抗炎癥反應的M2型極化，大量分泌IL-10、IL-4、IL-13以及轉(zhuǎn)化生長因子-β等，抑制抗炎因子表達，發(fā)揮營養(yǎng)和修復作用。

在Aβ持續(xù)激活下，MG從靜息狀態(tài)下過度活化、聚集，喪失生理警戒和抵御功能，過度產(chǎn)生的炎性介質(zhì)加劇神經(jīng)炎癥，造成嚴重神經(jīng)毒性，侵蝕損傷神經(jīng)元，甚至導致其凋亡[14]。激活的MG和死亡的神經(jīng)元可以釋放HMGB1，HMGB1又作用于MG，促進促炎癥因子或氧自由基釋放，誘發(fā)級聯(lián)放大效應，加重神經(jīng)炎癥，加重認知功能障礙及記憶力減退[15]；同時，HMGB1可以與Aβ結(jié)合，形成較難降解的Aβ寡聚體，抑制MG對Aβ的清除[16]。

IL-10作為主要抗炎細胞因子之一，在降低促炎性細胞因子表達的同時，還能促進Aβ清除，從而減輕Aβ誘導的AD樣變化[17-18]。

“通督啟神”法以百會、印堂、人中三穴作為主穴。該法基于“腦為髓?！?，又為元神之府，而“督脈者……上額，交巔，入絡腦”，根據(jù)腦、神、督脈之間密切聯(lián)系提出，在治療精神神志類疾病中取得明顯效果。百會是六陽經(jīng)與督脈交會穴，可調(diào)全身神識，為調(diào)神第一大穴。葉濤等[19]的研究顯示，電針百會可有效改善腦缺血再灌注造成的腦神經(jīng)損傷。宋長明等[20]的研究證實，電針百會、神庭穴可改善再灌注損傷后大鼠學習記憶能力，并能改善模型大鼠腦內(nèi)超微結(jié)構(gòu)。印堂居眉心正中，功能鎮(zhèn)驚醒神，降逆除煩。人中又名水溝，可溝通陰陽，為急救要穴，主醒神開竅，為諸多神經(jīng)精神疾患要穴。三穴配合，可以達到“通督啟神”的療效。

音樂電針以電流輸出波形模擬音樂節(jié)奏的低中頻電刺激，電流如音樂般頻率和振幅不斷變換，避免機體過度適應和耐受。音樂電針不僅具有刺激腧穴和音樂節(jié)奏治療的雙重作用，而且克服了以往普通脈沖電針易產(chǎn)生耐受性的缺點，在治療焦慮、抑郁等神經(jīng)精神疾病中取得很好效果[21-22]。

我們前期研究已經(jīng)證實，“通督啟神”法兩類電針能夠降低癡呆小鼠腦內(nèi)Aβ含量，進而改善其癡呆行為[23-24]。本研究顯示，在改善AD模型小鼠空間記憶方面，音樂電針組逃避潛伏期自訓練第3天起即明顯少于模型組，而脈沖電針組和藥物組則在第4天起少于模型組；音樂電針組逃避潛伏期少于脈沖電針組。目標象限游泳時間與總游泳時間之比也有相似的傾向。提示“通督啟神”電針可改善APP/PS1小鼠空間記憶，且音樂電針優(yōu)于脈沖電針，與本課題以往研究一致[25]。“通督啟神”電針均可降低AD小鼠海馬HMGB1的表達，增加IL-10表達，音樂電針更為明顯。

總之，本研究提示，“通督啟神”兩種電針均為行之有效改善AD的手段，且音樂電針干預效果更優(yōu)，其作用機制可能與其影響促炎因子HMGB1及抗炎因子IL-10，干預MG兩種不同極化有關。但其具體作用機制尚需要進一步研究。

[1]賈建平.神經(jīng)病學[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:217.

[2]Jia J,Wang F,Wei C,et al.The prevalence of dementia in urban and rural areasof China[J].Alzheimers Dement,2014,10(1):1-9.

[3]Azizi G,Mirshafiey A.Thepotential roleof proinflammatory and antiinflammatory cytokines in Alzheimer disease pathogenesis[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2012,34(6):881-895.

[4]Pimplikar SW.Neuroinflammation in Alzheimer's disease:from pathogenesis to a therapeutic target[J].JClin Immunol,2014,34(1 Suppl):64-69.

[5]Akiyama H,Barger S,Barnum S,et al.Inflammation and Alzheimer's disease[J].Neurobiol Aging,2000,21(3):383-421.

[6]Teeling JL,Perry VH.Systemic infection and inflammation in acute CNSinjury and chronic neurodegeneration:underlying mechanisms[J].Neuroscience,2009,158(3):1062-1073.

[7]Szekely CA,Breitner JC,Fitzpatrick AL,et al.NSAID use and dementia risk in the Cardiovascular Health Study Role of APOE and NSAID type[J].Neurology,2008,70(1):17-24.

[8]Breitner JC.NSAIDs and Alzheimer's disease:how far to generalise from trials?[J].Lancet Neurol,2003,2(9):527.

[9]謝藝婷,柳維林,陳立典,等.電針對阿爾茨海默病模型動物認知功能和組織病理學影響的研究進展[J].中國康復理論與實踐,2017,23(5):539-542.

[10]王穎,李威,張亢亢,等.不同頻率電針對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力和海馬突觸的影響[J].中國康復理論與實踐,2016,22(6):635-639.

[11]張軍,柯開富,邱一華,等.神經(jīng)炎癥在阿爾茨海默病發(fā)病機制中的作用[J].南通大學學報(醫(yī)學版),2012,32(1):44-47.

[12]Halliday G,Robinson SR,Shepherd C,et al.Alzheimer's disease and inflammation:a review of cellular and therapeutic mechanisms[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2000,27(1-2):1-8.

[13]Cunningham C.Microglia and neurodegeneration:The role of systemic inflammation[J].Glia,2013,61(1):71-90.

[14]Solito E,Sastre M.Microglia function in Alzheimer's disease[J].Front Pharmacol,2012,10(3):14.

[15]Mazarati A,Maroso M,Iori V,et al.High-mobility group box-1 impairs memory in mice through both toll-like receptor 4 and receptor for advanced glycation end products[J].Exp Neurol,2011,232(2):143-148.

[16]陳軒,王永紅.小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和阿爾茨海默病的關系[J].重慶醫(yī)科大學學報,2017,42(6):755-758.

[17]唐麗娜,許小明,李艷紅.炎癥因子與阿爾茨海默病的相關性研究進展[J].中國老年學雜志,2016,36(17):4378-4380.

[18]張憲亮.有氧運動及白藜蘆醇對Tg APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積的影響[D].上海:華東師范大學,2016.

[19]葉濤,朱路文,唐強,等.電針預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能和缺血半暗區(qū)Tolls樣受體4、核轉(zhuǎn)錄因子κB蛋白的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(7):745-749.

[20]宋長明,黃佳,林冰冰,等.電針百會、神庭穴對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(7):750-755.

[21]紀倩,李志剛,唐銀杉,等.不同電針刺激對慢性應激抑郁模型大鼠行為學及海馬谷氨酸轉(zhuǎn)運體的影響[J].針刺研究,2013,38(3):202-207,219.

[22]紀倩,梅旭暉,唐銀杉,等.音樂電針和脈沖電針對慢性應激抑郁大鼠行為學和海馬星形膠質(zhì)細胞的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(3):648-651.

[23]周源,李志剛,周阿劍,等.音樂電針對阿爾茨海默病模型小鼠學習記憶行為能力和海馬CA3區(qū)Aβ_(1-42)表達的影響[J].上海中醫(yī)藥大學學報,2015,29(3):76-80.

[24]唐銀杉,李志剛,陳萬順,等.音樂電針和脈沖電針對快速老齡化SAMP8小鼠行為學和血清Aβ蛋白的影響[J].中醫(yī)藥學報,2014,42(1):87-90.

[25]邵千楓,李昱頡,曹瑾,等.“通督啟神”法兩種電針對APP/PS1小鼠額葉皮層小膠質(zhì)細胞TNF-α表達的影響[J].世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2016,18(8):1327-1333.