環(huán)磷酸腺苷效應元件結合蛋白/腦源性神經營養(yǎng)因子信號通路在調心方改善APP/PS1小鼠學習記憶中的作用①

王曉雯，鄧海燕，王健，徐穎

1.上海中醫(yī)藥大學，a.康復醫(yī)學院；b.生理教研室，上海市201203

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是常發(fā)于老年人群的一種不可逆轉的中樞神經退行性疾病。AD患病率隨人口老齡化日益增加，目前，我國已有600～700萬老年癡呆患者，其中60歲以上老年人口患病率為5%～10%，85歲以上老年人口患病率則高達20%～50%[1]。AD起病隱匿，早期出現(xiàn)近期記憶力的減退，隨著病情的發(fā)展，患者的語言、計算、視空間和運動神經系統(tǒng)功能均有可能出現(xiàn)障礙，嚴重時可出現(xiàn)失語、妄想、錯覺，嚴重影響老年人的社會能力與生活質量[2-3]。

鹽酸多奈哌齊是治療AD的常用藥物，其臨床療效和安全性得到大量文獻報道證實。鹽酸多奈哌齊作為一種可逆性的乙酰膽堿酶抑制劑，能有效抑制乙酰膽堿水解，使得乙酰膽堿濃度增加，從而有效改善認知功能[4]。臨床研究顯示，調心方治療AD有一定的療效，尤其能改善認知功能障礙[5]。為進一步揭示其作用機理，本實驗將觀察各組小鼠海馬環(huán)磷酸腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)/腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)信號通路的變化，探討調心方改善APP/PS1雙轉基因AD小鼠學習記憶的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性APP/PS1雙轉基因小鼠54只，初始體質量(25.22±1.71)g，3月齡；同月齡同品系同性別下的C57BL/6J小鼠18只，初始體質量(30.49±1.59)g。所有小鼠均購自南京大學模式動物研究所，許可證號SCXK(蘇)2015-0001。實驗前所有小鼠經適應性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，溫度22～24℃，濕度60%。小鼠飼養(yǎng)及實驗遵守本地實驗動物管理委員會相關規(guī)定，均按照動物福利與倫理原則進行處理。

54只雄性APP/PS1雙轉基因小鼠按照隨機數(shù)字表分為模型組、調心方組和多奈哌齊組，每組18只；同時以同月齡同性別同品系下18只C57BL/6J野生雄性小鼠為對照組。

1.1.2 實驗試劑、藥品與儀器

Trizol、隨機引物、RNA酶抑制劑、First Strand cDNA synthesis Kit：美國INVITROGEN公司。RNA-free Water、QuantityNova SYBR Green PCR Kit：德國QIAGEN公司。TBE、6×loading buffer：上海威奧生物科技有限公司。RIPA、PMSF、BCA試劑盒、PBS緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、5×loading buffer、SDS-PAGE電泳液、Western轉膜液、彩色預染蛋白分子量標準(10～180 kD)：上海碧云天生物技術公司。化學發(fā)光液：美國THERMO SCIENTIFIC公司。脫脂奶粉、BSA粉末、無水乙醇、NC膜：北京鼎國昌盛生物技術有限公司。BDNF、磷酸化CREB(p-CREB)(S133)、GAPDH多克隆抗體：英國ABCAM公司。CREB多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H＋L)：美國CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

Morris視頻分析和跟蹤系統(tǒng)：荷蘭NETHERLANDS公司。組織勻漿器：北京鼎昊源公司。臺式高速離心機、全波長酶標儀：美國THERMO公司。瓊脂糖電泳、伯樂電泳設備：美國BIO-RAD公司。凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司。梯度PCR儀：美國LIFE公司。熒光定量PCR儀：瑞士ROCHE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 給藥

調心方采用配方顆粒，由黨參2.25 g、桂枝0.42 g、石菖蒲0.83 g、遠志0.38 g、龍骨0.5 g、甘草0.83 g、白芍0.5 g組成，江陰天江藥業(yè)有限公司生產。使用前，用蒸餾水充分溶解、混勻。鹽酸多奈哌齊片5 mg/片，批號H20030472，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產，使用前粉碎，蒸餾水溶解。

調心方組每天予調心方1.485 g/kg灌胃，多奈哌齊組予多奈哌齊0.083 mg/kg灌胃。對照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，給藥體積10 ml/kg，每天1次，連續(xù)12周。在整個灌胃過程中共死亡9只小鼠，其中調心方組6只，多奈哌齊組3只。

1.2.2 Morris水迷宮測試

給藥結束后第1天進行Morris水迷宮行為學測試。Morris水迷宮測試主要包括定位航行實驗和空間探索實驗。整個測試共持續(xù)6 d，其中定位航行實驗持續(xù)5 d，空間探索實驗在定位航行實驗結束后開始，為期1 d[6]。

實驗前1 d，將四組小鼠分別放入水中自由游泳，并且將小鼠放在手掌中，讓它適應水迷宮的環(huán)境以及實驗員的氣息。

定位航行實驗開始前，讓小鼠在實驗室里休息0.5 h，以減少小鼠的恐懼。平臺低于水面1 cm，設在第2象限中間的位置。將小鼠面向池壁從第3象限1/2弧度處和第4象限1/2弧度處以半隨機的方式放入水池中。每只小鼠60 s內找到平臺，并在平臺上保持5 s后記錄終止，作為逃避潛伏期；未在60 s內找到平臺的，記錄時間為60 s，并且實驗員需用小木棒引導小鼠找到平臺，并讓小鼠在平臺上停留30 s。定位航行實驗每天進行2個象限的訓練程序。在一個象限完全結束后，休息10 min，再進行另一個象限的訓練。

進行空間探索實驗時，需撤去原平臺，其余保持不變。選擇第3象限為入水點，記錄每只小鼠60 s內在各象限區(qū)域內停留的時間占總時間的百分比。

在Morris水迷宮行為學測試中，多奈哌齊組和模型組各有1只小鼠死亡。

各組隨機選取10只小鼠進行Morris水迷宮行為學測試。

1.2.3 制備腦組織樣本

Morris水迷宮行為學測試結束后第1天，各組隨機取7只小鼠，使用20%水合氯醛8 ml/kg麻醉處死，斷頭取腦。在冰盒上迅速剝離海馬，分別置于做好標記的EP管中，于-80℃液氮罐中儲存。隨后保存在凍層盒中，于-80℃冰箱中存儲備用。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitativepolymerasechain reaction,RT-qPCR)檢測

從-80℃冰箱中各組隨機取4只小鼠的海馬組織，采用磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內參基因，利用熒光定量PCR儀對目的基因BDNF和CREB進行定量檢測。采用Trizol法提取總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量，將電泳凝膠塊放在凝膠成像儀中拍照觀察所提總RNA樣品的完整性，并通過酶標儀檢測總RNA 的濃度和純度，確保 1.8＜OD260/OD280＜2.0。RNA純度測定后，利用cDNA合成試劑盒將RNA 2 μg逆轉錄為cDNA。PCR擴增條件：95℃預變性2 min，執(zhí)行一個循環(huán)；95℃5 s，60℃退火10 s，執(zhí)行45個循環(huán)。循環(huán)結束后60～95℃緩慢升溫，生成各基因的溶解曲線。通過BIO-RAD公司自帶的PCR系統(tǒng)軟件，觀察擴增曲線，記錄Ct值，采用2-△△Ct法進行相對定量。引物由NCBI Primer-blast設計，序列如下。

BDNF：上游 5′-GGT ATC CAA AGG CCA ACT GA-3′；下游5′-CTTATGAAT CGC CAG CCAAT-3′。

CREB：上游 5′-CAG ACA ACC AGC AGA GTG GA-3′，下游5'-GGGCTAATGTGGCAATCTGT-3′。

GADPH：上游5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′，下游 5′-TGTAGA CCA TGTAGT TGA GGT CA-3′。

1.2.5 Western blotting

從-80℃冰箱中各組取剩下3只小鼠的海馬組織，按蛋白提取試劑盒上操作要求提取蛋白，使用BCA法測定各組蛋白溶液的濃度，使用RIPA將各組蛋白定容至等體積，濃度為1μg/μl，加適量5×上樣緩沖液，混勻，煮沸10 min備用。10%～12%分離膠電泳分離目標蛋白并濕轉到NC膜上。非磷酸化的目的蛋白選用5%脫脂奶粉，磷酸化的目的蛋白選用5%BSA溶液搖床室溫封閉1 h，加入一抗：BDNF 1∶5000、p-CREB 1∶ 5000、 CREB 1∶ 3000、 GAPDH 1∶10000。搖床上4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶3000)，搖床室溫孵育1 h，化學發(fā)光法曝光，Alpha View SA圖像處理軟件分析條帶灰度。BDNF蛋白灰度與內參GAPDH蛋白灰度的比值作為BDNF蛋白的相對表達量，p-CREB蛋白灰度與CREB蛋白灰度的比值作為p-CREB蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗所得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，均以(xˉ±s)表示，各組小鼠逃避潛伏期數(shù)據(jù)比較采用多組重復測量的方差分析[7]。單組小鼠連續(xù)5 d的逃避潛伏期數(shù)據(jù)比較采用單組重復測量的方差分析，在各個時間點內各組小鼠逃避潛伏期的數(shù)據(jù)比較采用完全隨機設計多樣本比較的秩和檢驗。RT-qPCR和Western boltting四組數(shù)據(jù)比較均采用單因素方差分析，用LSD檢驗各組間的兩兩比較。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結果

2.1 Morris水迷宮測試

在定位航行實驗中，各組整體上分組效應(P＜0.001)和時間效應(P＜0.001)顯著，時間和分組因素具有交互作用(P＜0.05)。模型組連續(xù)5 d內逃避潛伏期無顯著性變化(P＞0.05)，調心方組連續(xù)5 d內逃避潛伏期逐漸減少(P＜0.05)。與對照組相比，模型組逃避潛伏期顯著延長(P＜0.001)。與模型組相比，調心方組逃避潛伏期顯著減少(P＜0.001)。見表1。

在空間探索實驗中，模型組在原平臺所在象限停留時間百分比較對照組顯著減少(P＜0.001)。與模型組比較，調心方組在原平臺所在象限停留時間百分比增加(P＜0.05)。見表2。

各組小鼠在目標象限的右邊象限和相對象限停留時間百分比均無顯著性差異(P＞0.05)。各組小鼠在目標象限的左邊象限有顯著性差異(P＜0.05)；與正常組比較，模型組在左邊象限停留時間百分比明顯增加(P＜0.01)，調心方組和多奈哌齊組在左邊象限停留時間百分比均無顯著性差異(P＞0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠在各象限停留時間百分比

2.2 CREB mRNA、BDNFmRNA表達

與對照組相比，模型組海馬CREB mRNA、BDNF mRNA表達降低(P＜0.05)。與模型組相比，調心方組海馬CREB mRNA、BDNFmRNA表達均增加(P＜0.05)；多奈哌齊組海馬CREB mRNA表達有增加的趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)，BDNF mRNA表達增加(P＜0.05)。見表3。

2.3 p-CREB、BDNF蛋白表達

與對照組相比，模型組小鼠海馬p-CREB、BDNF蛋白表達量均明顯減少(P＜0.01)。與模型組相比，調心方組海馬p-CREB、BDNF蛋白表達量均明顯增加(P＜0.01)；多奈哌齊組海馬p-CREB、BDNF蛋白表達量均增加(P＜0.05)。見表4、圖2。

表1 各時點各組小鼠逃避潛伏期比較(s)

表2 各組小鼠在原平臺所在象限停留的時間百分比(%)

表3 各組海馬CREB mRNA、BDNFmRNA表達比較(2-△△Ct)

表4 各組海馬p-CREB、BDNF蛋白表達比較(相對表達量)

圖2 各組海馬p-CREB、BDNF蛋白表達(Western blotting)

3 討論

根據(jù)AD發(fā)病特點和主要臨床表現(xiàn)認知功能障礙，可以認為AD和中醫(yī)“神”有密切關系。臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，心氣虛衰、氣不生神，致神明失用為AD發(fā)生、發(fā)展主要病機之一；痰滯瘀阻，蒙蔽神竅，神機失靈是促進AD的重要因素。調心方由黨參、石菖蒲、遠志等組成。黨參功擅補心氣，安神增智為君；菖蒲安神益智，開竅為佐；遠志通竅豁痰，增智為使。諸藥配伍具有益心氣化痰開竅之功效[5]。

Morris水迷宮是評估動物空間學習記憶的一種公認的方法[8]。它強迫實驗動物游泳，并學習尋找隱藏在水面下方安全平臺，目的是測試動物對空間位置感和方向感的學習記憶[9]，包括定位航行與空間探索實驗兩個階段。定位航行實驗反映動物的空間學習能力，并建立空間參考記憶[10]?？臻g探索實驗反映動物的空間記憶保持能力。逃避潛伏期和目標象限時間占總搜索時間百分比是最為常用且相對穩(wěn)定的參數(shù)。

本研究顯示，模型組訓練后沒有明顯的學習趨勢，沒有對原平臺位置形成明顯的空間記憶；而隨著訓練時間的增加，調心方組有明顯的學習趨勢，并形成對原平臺位置的記憶保持。

CREB是存在于真核生物細胞核內的組成性轉錄因子[11]，是一種重要的核蛋白[12]，與神經元的生長、損傷、再生，突觸可塑性，學習記憶密切相關[13-14]。CREB發(fā)揮多種與學習記憶相關的基因轉錄調控作用均有賴于ser133位點的磷酸化[15]。CREB能參與細胞內多條信號通路傳導途經，通過調節(jié)啟動子中的環(huán)磷酸腺苷效應元件調節(jié)下游靶基因的轉錄[16]。p-CREB能促進CRE序列的轉錄，并調節(jié)位于其下游的大量與學習記憶相關的基因的轉錄，如鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)[17]、BDNF等[18]，形成新的突觸聯(lián)系，進而形成海馬區(qū)長時程記憶[19]。當CREB磷酸化水平受抑制時，無法啟動和調控下游因子的轉錄，最終導致學習和記憶障礙[20]。

BDNF是在腦內合成，并分布于腦內多個部位的堿性蛋白質，以海馬的水平最高[21]。它能夠支持多種神經元生存、發(fā)育、分化及修復，促進突觸可塑性，對形成長時程記憶有幫助[22]。BDNF是CREB的經典下游靶基因，其基因啟動子區(qū)域含有CRE序列，受激活的CREB調控與轉錄。CREB磷酸化促進BDNF轉錄合成[23-24]。合成后的BDNF又可與其酪氨酸激酶B受體結合，激活PI3K/Akt、Ca2+/CaMK等通路，從而促進CREB激活[25]。BDNF mRNA表達上調，能形成上行傳導的神經信號，使中樞神經產生動作電位，進一步影響CREB mRNA表達上調[26]。

綜上所述，調心方可能通過調節(jié)CREB/BDNF的信號轉導通路，上調CREB蛋白磷酸化和基因表達水平，促進BDNF表達，從而起到延緩和預防AD發(fā)展的作用。

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