黃蕊,楊翠翠,李林,張?zhí)m
首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室,北京市神經(jīng)藥物工程研究中心,神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京市100053
阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅老年人健康的四大疾病之一。其主要特征是β淀粉樣蛋白(beta amyloid,Aβ)沉積和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)[1]。目前AD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,包括氧化、壓力和炎癥等多個(gè)致病因素[2-3],但越來(lái)越多的證據(jù)表明,神經(jīng)炎癥是AD發(fā)病的一個(gè)重要因素。在AD發(fā)病過(guò)程中,炎癥反應(yīng)是神經(jīng)元丟失的重要原因之一[4-6]。由于過(guò)量Aβ聚集和纖維化,小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活,炎癥因子大量釋放,誘發(fā)過(guò)度炎癥反應(yīng),導(dǎo)致突觸和神經(jīng)元大量損傷和丟失[7]。
二苯乙烯苷(2,3,5,4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside,TSG)是中藥何首烏的主要有效成分和標(biāo)志成分,具有抗衰老、神經(jīng)保護(hù)、降血脂以及抗動(dòng)脈硬化等作用[8]。多奈哌齊是第二代高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑,主要用于治療輕度和中度AD。課題組前期研究顯示,TSG能夠改善不同月齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙[9],并能改善β淀粉樣肽致癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶,增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)功能[10]。本實(shí)驗(yàn)用APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠為動(dòng)物模型,以多奈哌齊作為陽(yáng)性對(duì)照藥,探討TSG對(duì)Aβ沉積以及膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化的影響,從而進(jìn)一步證實(shí)TSG對(duì)AD的潛在治療作用。
SPF級(jí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠64只及野生型(wild type,WT)小鼠32只,體質(zhì)量30~35 g,購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物所,許可證號(hào)SCXK(蘇)2015-0001。小鼠分籠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室屏障環(huán)境,12 h光照,自由進(jìn)食和進(jìn)水,室溫20~25℃,濕度50%~70%。
TSG:本實(shí)驗(yàn)室從何首烏中提取,純度85%,實(shí)驗(yàn)中采用干粉劑,溶解于蒸餾水,制成藥液。多奈哌齊(國(guó)藥準(zhǔn)字H20050978,批號(hào)1502016):衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司。剛果紅染液(貨號(hào)MST-8013):上海邁新生物技術(shù)有限公司。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)(貨號(hào)ZA-0529)、一抗山羊血清(貨號(hào)ZLI-9021)、一抗稀釋液(貨號(hào)ZLI-9030)、生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG(貨號(hào)ZB-2010)、辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素(貨號(hào)ZB-2404)、DAB顯色試劑盒(貨號(hào)ZLI-9018):北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Aβ一抗(貨號(hào)2454):美國(guó)CELL SIGNALINGTECHNOLOGY公司。離子鈣結(jié)合蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)一抗(貨號(hào) 019-19741):日本W(wǎng)AKO公司。
BH-2光學(xué)顯微鏡:日本OLYMPUS公司。BS210S電子天平:北京賽多利斯天平有限公司。A78910100冰凍切片機(jī):美國(guó)THERMO公司。新物體識(shí)別設(shè)備:本室自制。
64只5月齡APP/PS1小鼠,按隨機(jī)數(shù)字表分為4組,每組16只。每天模型組予蒸餾水10 ml/kg灌胃;TSG低劑量組予TSG 0.05 g/kg灌胃;TSG高劑量組予TSG 0.1 g/kg灌胃;多奈哌齊組予多奈哌齊0.001 g/kg灌胃。
32只5月齡WT小鼠,按隨機(jī)數(shù)字表分為兩組,每組16只。每天正常對(duì)照組予蒸餾水10 ml/kg灌胃;TSG高劑量WT組予TSG 0.1 g/kg灌胃。
各組給藥時(shí)長(zhǎng)均為7個(gè)月,至小鼠12月齡。
給藥結(jié)束后,各組行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)第1天,將小鼠放于475×350×200 mm塑料空盒中自由探索10 min。第2天,在盒子里放置兩個(gè)相同物體,秒表記錄小鼠10 min內(nèi)對(duì)這兩個(gè)物體的探索時(shí)間,小鼠鼻子靠近物體1 cm距離內(nèi)視為對(duì)物體進(jìn)行探索。第3天,將其中一個(gè)物體換成新物體,秒表記錄小鼠在10 min內(nèi)對(duì)新舊物體的探索時(shí)間。計(jì)算識(shí)別指數(shù)(discrimination index,DI)。
新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)后,小鼠以10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉,開(kāi)胸,剪開(kāi)心包膜,暴露心臟和主動(dòng)脈弓。用7號(hào)鈍頭針頭插入左心室至主動(dòng)脈弓,剪開(kāi)右心耳,灌注0.9%氯化鈉注射液100 ml,待右心耳流出液無(wú)色透明時(shí),用4%多聚甲醛(pH=7.4)100 ml灌注固定至小鼠四肢僵直。灌注2 h后開(kāi)顱取腦,固定于后固定液中;1周后冰凍切片,冠狀位,片厚30 μm,連續(xù)切片。腦片置PBST緩沖液中,4℃儲(chǔ)存。
1.5.1 剛果紅染色
每組3只,每只取3張皮質(zhì)及海馬腦組織切片,撈至載玻片上,晾干,滴加飽和剛果紅染液染色10 min,滴加分化液約20 s,鏡下控制,水洗5 min;蘇木精淺染約10 s。梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。應(yīng)用Image J軟件計(jì)數(shù),以模型組斑塊數(shù)為1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(各組數(shù)據(jù)/模型組均值)。
1.5.2 免疫組化染色
每組3只,每只取3張腦片,撈至載玻片上,晾干。枸櫞酸緩沖液沸水煮10 min,PBS沖洗3次,每次5 min,3%H2O2室溫孵育10 min;PBS沖洗3次,每次5 min,10%山羊血清(PBST稀釋)室溫孵育30 min。棄去血清,滴加一抗及稀釋液,Aβ稀釋度為1∶200,Iba1稀釋度為1∶500,GFAP稀釋度為1∶200,4℃過(guò)夜。次日37℃復(fù)溫30 min,PBS沖洗3次,每次5 min,滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(PBST稀釋?zhuān)?∶100),37℃孵育2 h;PBS沖洗3次,每次5 min;滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素(PBST稀釋?zhuān)?∶100),37℃孵育1 h,PBS沖洗3次,每次5 min;DAB顯色液顯色,鏡下控制,并用自來(lái)水終止顯色。梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。Aβ、Iba1和GFAP染色陽(yáng)性面積用Image-pro Plus 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),以模型組面積為1,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(各組數(shù)據(jù)/模型組均值)。
數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用(xˉ±σXˉ)表示,多組間樣本比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)。顯著性水平α=0.05。
與正常對(duì)照組相比,模型組DI降低(P<0.05);與模型組相比,各治療組DI均明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。
表1 各組新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)DI比較
與正常對(duì)照組相比,模型組皮層及海馬均散在分布大量磚紅色斑塊(P<0.001),與AD疾病細(xì)胞外斑塊沉積病理改變一致。與模型組相比,各治療組腦內(nèi)斑塊沉積均有不同程度減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1~圖4。
與正常對(duì)照組相比,模型組皮層及海馬出現(xiàn)大量褐色團(tuán)塊狀A(yù)β40/42沉積(P<0.001)。與模型組相比,各治療組小鼠皮層及海馬Aβ40/42沉積均有不同程度減少(P<0.05)。見(jiàn)圖5~圖8。
正常對(duì)照組與TSG高劑量WT組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常且分布均勻,模型組海馬染色呈現(xiàn)團(tuán)塊狀分布(活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞),Iba-1和GFAP陽(yáng)性面積顯著增加(P<0.001)。與模型組相比,各治療組海馬部位Iba-1和GFAP陽(yáng)性面積均有所減少(P<0.05)。見(jiàn)圖9~圖12。
圖1 各組皮層淀粉樣斑塊沉積情況比較
圖2 各組海馬淀粉樣斑塊沉積情況比較
圖3 各組皮層淀粉樣斑塊沉積(剛果紅染色,20×)
圖4 各組海馬淀粉樣斑塊沉積(剛果紅染色,20×)
圖5 各組皮層Aβ40/42沉積情況比較
圖6 各組海馬Aβ40/42沉積情況比較
圖7 各組皮層Aβ40/42沉積(免疫組化染色,20×)
圖8 各組海馬Aβ40/42沉積(免疫組化染色,20×)
圖9 各組海馬Iba-1表達(dá)情況比較
圖10 各組海馬GFAP表達(dá)情況比較
圖11 各組海馬Iba-1表達(dá)(免疫組化染色,40×)
圖12 各組海馬GFAP表達(dá)(免疫組化染色,40×)
AD的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜,AD腦內(nèi)病變是一個(gè)慢性炎癥的觀點(diǎn)已被普遍接受。AD腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)涉及大量細(xì)胞和分子,包括與Aβ沉積和老年斑形成有關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,以及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)增加,同時(shí)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[11-13]。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞的主要類(lèi)型,反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞與AD中斑塊密切相關(guān)[14]。
剛果紅染色能顯示腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積,是診斷淀粉樣變性最簡(jiǎn)便易行的方法[15],也常應(yīng)用于淀粉樣蛋白示蹤劑研究[16-17]。本研究顯示,12月齡APP/PS1小鼠腦內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)大量老年斑;給予TSG后,老年斑數(shù)量有所減少;Aβ40/42也顯示同樣趨勢(shì)。這印證了Aβ40/42是老年斑的主要成分[18]。Aβ經(jīng)淀粉樣前體蛋白水解產(chǎn)生,并可以被胰島素降解酶、中性內(nèi)肽酶等水解酶水解清除[19-20]。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,小膠質(zhì)細(xì)胞約占成年腦細(xì)胞的5%~10%[21]。正常生理狀態(tài)下,小膠質(zhì)細(xì)胞處于抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)的狀態(tài);Aβ可作為始動(dòng)因素激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),過(guò)度增殖和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放大量炎癥因子和過(guò)氧化物,加重炎癥反應(yīng)強(qiáng)度,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22-23]。
Iba1是小膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá),約17 kDa的鈣結(jié)合蛋白,在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高。本研究中12月齡模型小鼠腦內(nèi)Iba1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化呈團(tuán)塊狀,與文獻(xiàn)中描述一致[24],而治療組腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度明顯降低。
星形膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)組織損傷后修復(fù)過(guò)程,約占神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總數(shù)35%[25]。與小膠質(zhì)細(xì)胞一樣,星形膠質(zhì)細(xì)胞暴露于Aβ后釋放炎癥因子,加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng)。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要成分,可標(biāo)記正常和活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。本研究中12月齡模型小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化,治療組星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度明顯降低。TSG對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化的抑制,說(shuō)明TSG的顯著抗炎作用。
綜上所述,目前認(rèn)為Aβ引起的神經(jīng)炎性損傷是AD的重要發(fā)病機(jī)制之一,小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞作為主要的免疫細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)過(guò)程。通過(guò)7個(gè)月給予TSG,12月齡AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善,腦內(nèi)老年斑以及組成老年斑的主要成分Aβ40/42減少,同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化被抑制,推測(cè)TSG可能通過(guò)抑制APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ的形成,減少斑塊沉積,進(jìn)而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,降低炎癥反應(yīng),同時(shí)改善學(xué)習(xí)記憶。
本文通過(guò)免疫組化染色,直觀呈現(xiàn)各組小鼠腦內(nèi)Aβ40/42沉積、小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài),將為進(jìn)一步研究TSG的抗炎作用機(jī)制提供有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。TSG對(duì)于Aβ的減低是通過(guò)降低Aβ的生成還是增加Aβ的清除,TSG是否通過(guò)降低炎癥因子發(fā)揮其抗炎作用,以上機(jī)制目前尚不明確,還需進(jìn)一步深入研究。
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