白楠大小孢子發(fā)生與雌雄配子體的發(fā)育觀察

鄧金勝+張建+況紅玲+張欣+喻峰+杜丹+王昆

摘要：白楠為樟科楠屬植物，是優(yōu)秀的生態(tài)樹種和珍貴的用材樹種，具有很高的價(jià)值。本文采用石蠟切片法對(duì)白楠（Phoebeneurantha）的胚胎發(fā)育過程進(jìn)行了研究。主要內(nèi)容包括白楠大、小孢子發(fā)生，雌、雄配子體的發(fā)育以及開花后子房發(fā)育的研究。主要研究結(jié)果表明，白楠的子房為一室，雙珠被，厚珠心，多單胚珠，少數(shù)雙胚珠，倒生。胚囊發(fā)育類型為蓼型胚囊，與樟科其他屬種一致，大孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成直線排列的四個(gè)大孢子，其中三個(gè)靠近珠孔端的大孢子相繼退化死亡，而合點(diǎn)端的大孢子則發(fā)育成為功能大孢子，形成單核胚囊，經(jīng)過三次分裂，形成八核七細(xì)胞的成熟胚囊。雄蕊花藥為四室，花藥壁自外向內(nèi)分別為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層，隨著花藥的進(jìn)一步發(fā)育，藥室內(nèi)壁和絨氈層逐漸解體消失，成熟花粉為二細(xì)胞型花粉，絨氈層類型為變形絨氈層。小孢子有部分?jǐn)∮F(xiàn)象，這可能是由于絨氈層不能及時(shí)降解，導(dǎo)致小孢子無法吸收營養(yǎng)，從而導(dǎo)致敗育。

關(guān)鍵詞：白楠；大、小孢子發(fā)生；雌、雄配子體發(fā)育；敗育

中圖分類號(hào)：Q132文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-3020（2017）06-0006-06TheMegasporogenesis，

Microsporogenesis，F(xiàn)emaleandMaleGametophyteDevelopmentofPhoebeneuranthaDengJinsheng（1）ZhangJian（2）FangHongling（1）ZhangXin（1）YuFeng（1）DuDan（1）WangKun（1）

（1.FayeEcologicalEnvironmentGroupCo.，LTDWuhan430206；2.YangtzeUniversityJingzhou434100）Abstract：PhoebeneuranthaisexcellentecologicalspeciesandraretreespeciesofLauraceaePhoebenees，hasaveryhighvalue.MethodofusingparaffinPhoebeneuranthatostudytheprocessofembryonicdevelopment.Maincontentsincludethemegasporogenesis，microsporogenesis，developmentofmaleandfemalegametophyteandstudyonovarydevelopmentafterflowering.MainresultsshowthattheovaryofPhoebeneuranthahad1-locules，doubleintegyment，thicknucellus，singleovule，afewpairofovules，ovuleswasanatropous.Embryosacdevelopmenttypeforpolygonumtype，andLauraceaeotherisspeciesconsistent，themegasporesmothercellformedalineartetradof4megasporesaftermeiosis.Thechalazalmegasporedevelopedthefunctionaloneandotherthreeatthemicropylarpoleweredegraded.Formedsinglenuclearembryosac，afterthreetimessplit，formedeightnuclearsevencellofmatureembryosac.Therewrer4loculesanthersacinflowers，Thewallofflowersisconsistofepiderment，endothecaendothecium，middlelamellaandtapetum.Alongwiththefurtherdevelopmentoftheanther，endotheciumanddisintegrationoftapetalcellsgraduallydisappear，maturepollengrainswere2-celledtypes.Thetapetumwasamoeboid.Therewerelittlepollenabortionandmalesterilitysincethetapetumofmalesterileplantsdelayeddegradationandthemicrosporescouldnotobtainenoughnutritionfornormaldevelopment.

Keywords：Phoebeneurantha；megasporogenesisandmicrosporogenesis；maleandfemalegametophytesdevelopment；abortion

白楠是樟科楠屬植物，為多年生大灌木至喬木，通常高3～14m；樹皮灰黑色。小枝剛開始有較短柔毛或是長柔毛，柔毛會(huì)隨著發(fā)育逐漸消失。葉為革質(zhì)葉，狹披針形、披針形或倒披針形，長80～160cm，寬15～40cm，葉片先端尾狀漸尖，基部漸狹下延，極少為楔形，葉片上面無毛或嫩時(shí)有毛，下面為綠色或蒼白色，葉片嫩時(shí)有或多或少的灰白色柔毛，后來會(huì)逐漸變?yōu)樯⑸崦蚴菬o毛，葉脈的中脈下陷，葉片兩邊分別有側(cè)脈8～12條，且有著較明顯的橫脈和小脈；葉柄長7～15mm，被柔毛或近于無毛。白楠為圓錐花序，花長4～5mm，花梗被毛，長3～5mm；花被片為卵狀，外輪的花被較短且狹窄，內(nèi)輪與之相反，長且寬，花被片先端不尖，較鈍，內(nèi)面毛特別密集；每輪花絲上有較長柔毛，花內(nèi)腺體沒有柄，著生在第三輪花絲的基部，退化后的雄蕊有柄，且有較長柔毛；子房球形，花柱伸長，柱頭盤狀。果實(shí)為卵形，長度為1mm，寬度為7mm；在生長發(fā)育時(shí)果梗會(huì)略微變粗；宿存的花被片為革質(zhì)，排列較松散，花被片的先端有時(shí)會(huì)向外傾斜，具有明顯的縱脈?；ㄆ?月，果期8～10月[1]。endprint

白楠為耐陰樹種，適合生長在氣候溫暖濕潤的地方，對(duì)土質(zhì)的要求為較疏松且排水較良好的土地，尤其是在中性或偏酸性的壤質(zhì)土地上，生長得非常良好，白楠的根部有著很強(qiáng)的萌發(fā)力，能短期耐澇。壽命較長，較抗蟲，能長成大徑材[2]。主要生長在山地密林中，產(chǎn)于我國的湖北、江西、四川、云南、貴州等地。

白楠是珍貴的用材樹種。木材顏色為黃褐色，與樟科植物一樣具有芳香味。且木材的構(gòu)造較細(xì)，硬度較強(qiáng)，密度不大，不容易受到擠壓變形，耐腐蝕不容易被蟲蛀。木材易加工，經(jīng)過稍微加工木材紋理就會(huì)變得光滑美觀，是用來做家具、雕刻和建筑的非常好的材料。也是用來制作緊密儀器和造船材料的不二選擇[3]。且樹形優(yōu)美，枝繁葉茂，生長非常迅速，是極佳的庭蔭樹種和綠化樹種。同時(shí)白楠也是亞熱帶常綠闊葉林中及其重要的伴生樹種，有著非常強(qiáng)大的生態(tài)調(diào)節(jié)功能。所以發(fā)掘和使用白楠這一珍貴樹種資源具有重要意義[4]。

湖北林業(yè)科技第46卷第6期鄧金勝，等：白楠大小孢子發(fā)生與雌雄配子體的發(fā)育觀察楠木向來有“木中金子”之稱，其材質(zhì)通直圓滿、紋理美觀、結(jié)構(gòu)細(xì)致、質(zhì)韌難朽、奇香不衰，用途十分廣泛，為江南四大名木之冠。由于楠木巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的用途，導(dǎo)致其野生資源被破壞得極其嚴(yán)重，目前已難覓天然楠木林，許多楠屬植物淪為瀕?；驖u危樹種[5]。根據(jù)《中國植物紅皮書—稀有瀕危植物名錄》（第一冊(cè)）和1999年國務(wù)院批準(zhǔn)發(fā)布的《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》（第一批），楠屬的楠木（Phoebezhennan）、閩楠（P.boumei）、浙江楠（P.chekiangensis）、滇楠（P.nanmu）等均為瀕危種，為國家Ⅱ級(jí)保護(hù)植物[6-7]。要保護(hù)楠木資源，首要任務(wù)是要為其提供較強(qiáng)的繁殖能力。從繁殖的角度來看，種子植物有性生殖過程大致可分為4個(gè)階段：雌雄配子的發(fā)育、傳粉與受精、胚發(fā)育和

果實(shí)（種子）成熟、成熟種子散步與萌發(fā)[8]。

而目前對(duì)于楠木各個(gè)樹種的研究報(bào)道很少，無法對(duì)其生殖生育的整個(gè)過程形成一個(gè)系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，對(duì)于白楠的研究幾乎沒有。本研究在前人的研究基礎(chǔ)上，對(duì)白楠花發(fā)育過程中，大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體的形成進(jìn)行了詳細(xì)的細(xì)胞學(xué)觀察和研究，旨在為該種資源保護(hù)、良種繁殖和系統(tǒng)進(jìn)化研究提供生殖生物學(xué)方面的基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本研究采用的實(shí)驗(yàn)材料來自長江大學(xué)盆景園內(nèi)的白楠樹。從它的花期開始，每隔3d采集一次，采集不同時(shí)期的白楠花，取材料時(shí)用高枝剪剪下。采集材料之后用70%FAA溶液進(jìn)行固定。70%FAA溶液由5mL甲醛、冰5mL乙酸和90mL70%乙醇組成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1常規(guī)石蠟切片法的制片過程

（1）材料固定：將小花投入裝有FAA固定液（20倍材料）中的青霉素小瓶，用真空抽氣泵緩慢抽去花芽中的氣泡，等到花芽沉入瓶底后，停止抽氣，更換FAA固定液。放入4℃冰箱，固定4h以上。

（2）脫水：抽氣完成后，將花芽從FAA中取出，依次通過50%、70%、85%、95%、100%濃度的酒精浸泡潤洗，每個(gè)濃度浸泡2h。

（3）透明：花芽從100%乙醇取出后依次經(jīng)1/2二甲苯+1/2無水乙醇、二甲苯透明，每一級(jí)2h。

（4）浸蠟：脫水時(shí)間足夠后，將杯中的二甲苯倒掉一部分，留約1/3左右的二甲苯置于杯中，然后塞入軟蠟蠟屑，放入溫度為38℃的烘箱中過夜，第二天將軟蠟倒掉，倒入純蠟蠟液，將烘箱溫度調(diào)整為62℃，4h換一次純蠟，共換3次。

（5）包埋：將融化的純蠟和材料的混合物一起倒入紙盒中，用加熱的鑷子將其鋪開排列整齊，然后將其浸入冷水中使其冷卻凝固。

（6）切片：找到材料的縱切和橫切方向，將其粘在蠟臺(tái)上。將粘好蠟塊的蠟臺(tái)固定在切片機(jī)上，并使蠟塊的水平方向與刀片平行，進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度8～10μm。

（7）粘片：取干凈的載玻片，在上面涂上適量的明膠，滴加少量蒸餾水，從蠟帶上切下1小段粘在載玻片上，在42℃展臺(tái)上展片，切片烘干展平后取下放入切片盒中，放置2d以上方可染色。

（8）染色封片：采用番紅-固綠對(duì)染，石蠟切片→二甲苯脫蠟（5min）→1/2二甲苯+1/2無水乙醇（2min）→100%乙醇（2min）→95%乙醇（2min）→85%乙醇（2min）→70%乙醇（2min）→50%乙醇（2min）→蒸餾水（2min）→1%番紅染液（2h）→蒸餾水（1min）→50%乙醇（1min）→70%乙醇（1min）→85%乙醇（1min）→95%乙醇（1min）→0.1%或0.5%固綠染液（40s）→95%酸酒精（1min）→100%乙醇（2min）→1/2二甲苯+1/2無水乙醇（2min）→二甲苯透明（5min）→樹膠封片，貼好標(biāo)簽。其中樹膠的配方為明膠2g、石炭酸4g、甘油30mL、蒸餾水200mL。

1.3觀察與照相

在光學(xué)顯微鏡下觀察做好的切片，并用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。

2結(jié)果與分析

2.1白楠花的形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

白楠花的整體結(jié)構(gòu)，自外向內(nèi)由外層苞片、內(nèi)層苞片、雄蕊、雌蕊組成，白楠花中存在著很多粘液細(xì)胞和油細(xì)胞（圖1a）。白楠有雄蕊9枚，外輪6枚，內(nèi)輪3枚，并且存在著腺體（圖1b）。一個(gè)成熟的花藥是由花粉囊和藥隔兩部分組成，白楠的花藥有四室，花藥由表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層組成，在藥室內(nèi)壁上可以觀察到明顯的粘液細(xì)胞（圖1c）。

關(guān)于白楠雌蕊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，觀察發(fā)現(xiàn)在白楠中存在著少數(shù)雙胚現(xiàn)象，由圖1d可以看到胚囊中有兩個(gè)正在發(fā)育的胚珠。白楠的胚珠為倒生胚珠（圖1e），形成倒生胚珠的原因?yàn)榉至押髢蓚?cè)生長的速度不一致而導(dǎo)致。白楠柱頭的形狀為兩頭窄，中間較寬，在柱頭旁邊還存在著腺體（圖1f）。

a.花的縱切b.花的橫切c.花藥四室d.白楠的雙胚珠現(xiàn)象e.倒生胚珠f.雌蕊的縱切endprint