油茶葉綠素提取方法的比較研究

程貴文+龔洪恩+顏送寶+陳傳松+羅嘉東+袁小平+吳建國

摘要：為尋求油茶葉綠素提取效果最好的方法，以長林4號油茶葉片為試材，研究5種不同提取方法對油茶葉片葉綠素提取效果的影響。結(jié)果表明：不同提取方法提取效果差異顯著，提取效果最好的是丙酮∶乙醇=2∶1的混合液，其次是丙酮∶乙醇=1∶1的混合液，然后是丙酮∶乙醇∶水=45∶45∶1的混合液，80%丙酮和95%乙醇提取效果相對較差。丙酮∶乙醇2∶1混合液法比較適合油茶葉綠素的提取。

關(guān)鍵詞：油茶；葉綠素；提取方法

中圖分類號：S7223文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1004-3020（2017）06-0011-04ComparisonofChlorophyllExtractionMethodsinCamelliaoleiferaChengGuiwenGongHongenYanSongbaoChenChuansongLuoJiadongYuanXiaopingWuJianguo

（TheExperimentalCentreofSubtropicalForestry，CAFXinyu336600）

Abstract：InordertofindoutthebestextractionmethodofchlorophyllinCamelliaoleifera，theeffectsoffivedifferentextractionmethodsontheextractionofchlorophyllwerestudied，withCamelliaoleiferaleavesofChanglin4asexperimentalmaterial.Theresultsshowedthatdifferentextractionmethodsshowedsignificantdifferencethe，mixedreagentofacetoneandethylalcoholinratioof2∶1hadthebesteffect，followedbythemixedreagentofacetoneandethylalcoholinratioof1∶1，thenthemixedreagentofacetone，ethylalcoholandwaterinratioof45∶45∶1，80%acetoneand95%ethanolhadrelativelypooreffect.Themixtureofacetoneandethanolinratioof2：1issuitablefortheextractionofchlorophyllfromCamelliaoleifera.

Keywords：Camelliaoleifera；chlorophyll；extractionmethods

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用最重要的物質(zhì)之一。早期一段時間葉綠素提取主要采用Arono法[1]，該方法缺點(diǎn)是需研磨、過濾，步驟多，工作量大，且易受光氧化；1976年Shoaf提出了用二甲基亞砜提取藻類葉綠素，1979年Hiscox將該方法用于提取高等植物葉綠素[2]，該方法缺點(diǎn)是二甲基亞砜氣味難聞，成本高，且低于19℃就會結(jié)晶；1981年古川昭雄提出了用無水乙醇浸泡提取葉綠素的方法[3]，該方法的缺點(diǎn)是提取時間長，提取不完全等；1984年福建林科所陳福明提出了丙酮、無水乙醇和蒸餾水45∶45∶1的混合液浸泡提取葉綠素的方法[4]，隨后沈陽農(nóng)學(xué)院張憲政于1985年提出了丙酮和無水乙醇1∶1的混合液法[5]，1992年北京農(nóng)業(yè)大學(xué)彭運(yùn)生又提出了丙酮和無水乙醇2∶1的混合液法[6]。

就油茶葉綠素提取而言，雖然目前幾種方法都有采用，但提取效果的比較研究尚未見報道。本研究以長林4號油茶葉片為試材，對80%丙酮浸提法[7-15]、95%乙醇浸提法[16-19]、45∶45∶1混合液法（丙酮∶乙醇：水）[20-24]、1∶1混合液法（丙酮∶乙醇）[25-28]和2∶1混合液法（丙酮∶乙醇）[29-32]的油茶葉綠素提取效果進(jìn)行比較研究，以期為油茶葉綠素含量測定方法的選擇提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

選取長林4號盛產(chǎn)期油茶樹向陽中上部葉片，擦拭干凈，去除大葉脈，剪碎成約10cm×02cm的細(xì)絲，遮光混勻備用。

1.2試驗(yàn)方法

按體積比配制浸提液，共5個處理：①80%丙酮；②95%乙醇；③丙酮∶乙醇=1∶1；④丙酮∶乙醇=2∶1；⑤丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1。將剪好的細(xì)絲稱取0.2000g，放入裝有浸提液的25ml具塞刻度試管，定容，置于暗處室溫浸提24h，每個處理重復(fù)3次，期間搖動幾次。提取液分別于470、645、663nm波長下測定吸光度（95%乙醇提取液于470、649、665nm波長下測定吸光度），重復(fù)3次。葉綠素濃度按Arnon[1]公式計算：

Ca=12.71A663-2.59A645

Cb=22.88A645-4.67A663

Ca+b=Ca+Cb=20.29A645-8.04A663

Cx，c=（1000A470-3.27Ca-104Cb）/229

95%乙醇提取液葉綠素濃度按下列公式計算[33]：

Ca=13.95A665-6.88A649

Cb=24.96A649-7.32A665

Ca+b=Ca+Cb=18.08A649+6.63A665

Cx，c=（1000A470-2.05Ca-114.8Cb）/245

葉綠素含量（mg/g）=C·V/1000Fw

式中：A665、A663、A649、A645、A470分別為相應(yīng)波長下的吸光值；V為提取液總體積（ml）；Fw為所取葉片鮮重（g）；Ca、Cb、Ca+b和Cx，c分別為葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素濃度，單位為（mg/L）。endprint

1.3數(shù)據(jù)分析

采用MicrosoftExcel2003和SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

湖北林業(yè)科技第46卷第6期程貴文，等：油茶葉綠素提取方法的比較研究2結(jié)果與分析

2.1不同提取方法對油茶葉綠素a含量的影響

不同提取方法下油茶葉綠素a含量如圖1所示，從圖中可以看出不同提取方法下油茶葉綠素a含量存在極顯著性差異，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，葉綠素a提取含量達(dá)2178mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液，葉綠素a提取含量為2107mg/g；其它3種提取效果相對較差，最差的是80%丙酮提取液，葉綠素a提取含量為1733mg/g，僅為效果最好的7957%。

注：①80%丙酮；②95%乙醇；③丙酮∶乙醇=1∶1；

④丙酮∶乙醇=2∶1；⑤丙酮∶乙醇∶水=45∶45∶1。

不同小寫字母表示差異顯著（P<005）。下同。

2.2不同提取方法對油茶葉綠素b含量的影響

如圖2所顯示，不同提取方法下油茶葉綠素b含量存在顯著性差異，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，葉綠素b提取含量達(dá)0711mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液與80%丙酮，葉綠素b提取含量分別為0668mg/g和0633mg/g；其它2種提取效果相對較差，最差的為0589mg/g（丙酮∶乙醇∶水=45∶45∶1），是效果最好的8284%。

2.3不同提取方法對油茶葉綠素總含量的影響

從圖3可以看出，不同提取方法下油茶葉綠素總含量存在極顯著性差異，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，葉綠素總提取量達(dá)2889mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液，葉綠素總提取量為2775mg/g；其它3種提取效果相對較差，最差的是95%乙醇提取液，葉綠素總提取量為2335mg/g，僅為效果最好的8082%。

2.4不同提取方法對油茶葉綠素a/b的影響

從圖4可以看出，不同提取方法下油茶葉綠素a/b值差異性并不顯著，a/b值最大的是3154（丙酮∶乙醇=1∶1），最小的是2738（80%丙酮）。

2.5不同提取方法對油茶類胡蘿卜素含量的影響

由圖5可以看出，不同提取方法下油茶類胡蘿卜素含量存在顯著性差異，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，類胡蘿卜素提取量達(dá)0661mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液與95%乙醇，類胡蘿卜素提取量分別為0652mg/g和0643mg/g；最差的是80%丙酮提取液，類胡蘿卜素提取量為0565mg/g，為效果最好的8548%。

3討論

5種不同提取方法下油茶葉綠素的提取含量差異顯著，其中葉綠素a含量和葉綠素總含量達(dá)到極顯著水平，葉綠素b含量和類胡蘿卜素含量達(dá)到顯著水平，且丙酮和乙醇混合液提取效果比丙酮、乙醇單獨(dú)提取效果好，可能原因是丙酮和乙醇間存在協(xié)同萃取效應(yīng)[34]，兩者混合能夠促進(jìn)葉綠素的提取效率；不同提取方法下油茶葉綠素a/b值差異性并不顯著，這是因?yàn)椴煌崛》椒ㄌ崛〉娜~綠素a含量與葉綠素b含量具有相似的變化趨勢，所以其比值變化不顯著。葉綠素a/b值的高低與葉綠素提取液濃度有密切的關(guān)系，葉綠素提取液總濃度在35～60mg·L-1之間，該比值變化不大，超過該范圍，比值隨提取液濃度的降低而增大，隨提取液濃度的升高而減小[35]。本試驗(yàn)提取液濃度均在467～5778mg·L-1之間，所測值比較穩(wěn)定。

4結(jié)論

綜合分析表明，丙酮乙醇2∶1混合液法為長林4號油茶葉片葉綠素提取的最佳方法。與常規(guī)研磨法相比，該方法具有操作程序簡單、步驟少、工作量小、受光影響小等優(yōu)點(diǎn)[6]，對于批量測定油茶葉綠素含量具有重要的意義。

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