慢病毒載體表達系統(tǒng)的研究進展

辛凌翔　常迪

摘要：作為運載工具，慢病毒載體將插入的目的基因?qū)胫了拗骷毎麅?nèi)，目的基因由此可于宿主細胞內(nèi)進行復制或表達，因其具有廣闊的宿主范圍且能更加有效地引起細胞感染而被視為常用的基因?qū)敕绞街弧１疚膰@慢病毒載體的構(gòu)成、慢病毒載體表達系統(tǒng)的優(yōu)勢及演變等，開展相關(guān)研究狀況的系統(tǒng)綜述。

關(guān)鍵詞：慢病毒載體；病毒包裝；基因表達

慢病毒（Lentivirus）為二倍體RNA病毒，屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科（Retrovidae），其感染特征為經(jīng)顯性或隱性感染后，潛伏期較長，感染動物發(fā)病緩，常見的有：HIV（人類免疫缺陷病毒）、FIV（貓免疫缺陷病毒）以及EIAV（馬傳染性貧血病毒）等。慢病毒于宿主細胞中第一步會通過自身反轉(zhuǎn)錄酶作用，結(jié)合病毒RNA產(chǎn)生eDNA；第二步是將上一步驟所得eDNA當做模板，由此產(chǎn)生雙鏈DNA；第三步，經(jīng)過雙鏈DNA環(huán)化反應，同時通過病毒整合酶作用，在宿主細胞染色體上依次進行整合與表達翻。

1慢病毒載體的結(jié)構(gòu)

慢病毒載體作為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一類，其基礎為慢病毒，其病毒基因組內(nèi)含有關(guān)系到病毒活性以及病毒復制的重要序列，去掉此類序列，再根據(jù)試驗需要，在其基因組骨架中插入目的基因的序列，這樣既可以保證其生物安全性，又能達到基因轉(zhuǎn)移的目的。就整個慢病毒載體系統(tǒng)而言，應用率最高的為HIV載體系統(tǒng)，且所獲研究成果最多的為HIV-1型載體系統(tǒng)。以HIV-1的基因結(jié)構(gòu)為例，HIV-1屬雙鏈RNA病毒，共含9個基因（如圖1所示）。

編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因主要有g(shù)ag、pol和env。其中，gag負責編碼合成衣殼蛋白、內(nèi)膜蛋白以及核衣殼蛋白等關(guān)鍵蛋白，pol負責編碼病毒復制相關(guān)酶，env負責編碼病毒包膜糖蛋白。

編碼病毒調(diào)節(jié)蛋白的基因主要有rev和詛t。rev參與調(diào)節(jié)蛋白的表達，tat參與控制蛋白的轉(zhuǎn)錄。LTR為病毒的長末端重復序列，其內(nèi)存在順式作用原件，LTR結(jié)合tat后能對病毒基因轉(zhuǎn)錄起促進作用。vif、vpr、vpu、nef為輔助基因，將輔助基因編碼的蛋白當做毒力因子，可用來主導宿主細胞的感染以及識別。此外，在構(gòu)成上，HIV-1的基因組還提供了病毒整個生命周期涉及到的其他序列結(jié)構(gòu)，諸如包裝信號、病毒復制信號等。

2慢病毒載體表達系統(tǒng)的優(yōu)勢

在所有外源基因?qū)爰毎姆椒ㄖ校瑧幂^為廣泛的有DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)、磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)、聚陽離子-DSMO轉(zhuǎn)染技術(shù)、電穿孔技術(shù)、顯微注射技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)等。在外源基因表達中發(fā)揮關(guān)鍵作用的病毒表達載體現(xiàn)已成為應用率最高的基因?qū)牍ぞ咧?，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰疹病毒載體以及腺病毒載體等。慢病毒載體因其具有轉(zhuǎn)染細胞廣泛、感染效率高、導入基因片段量容量大且表達穩(wěn)定等諸多優(yōu)點，被視為理想的可轉(zhuǎn)移目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在疫苗研發(fā)、藥物開發(fā)等領(lǐng)域有著廣泛的應用閻，其具體優(yōu)勢如下：

2.1轉(zhuǎn)染細胞廣泛

不管細胞分裂活躍與否，抑或細胞處在哪個分裂階段，慢病毒載體都能夠保持轉(zhuǎn)染的廣泛性，尤其對于原代細胞、干細胞、不分化的細胞等較難轉(zhuǎn)染的細胞（如造血干細胞、神經(jīng)干細胞、肌纖維細胞等）均具有高效的基因轉(zhuǎn)導效率，由此，愈來愈多的針對相關(guān)疾病基因療法的臨床研究開始大量應用慢病毒載體。有試驗發(fā)現(xiàn)，不管是體外進行的細胞與組織培養(yǎng)研究，或是體內(nèi)進行的基因治療研究，對于神經(jīng)膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元，慢病毒載體均表現(xiàn)出轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性與高效性。

2.2導入基因表達穩(wěn)定

研究發(fā)現(xiàn)，不管是體內(nèi)移植試驗，還是體外細胞培養(yǎng)，以慢病毒載體導入的目的基因均可以有效地抵抗轉(zhuǎn)錄沉默影響，同時，可以于靶細胞內(nèi)保持表達的穩(wěn)定性及持續(xù)性。

2.3可兼容多個轉(zhuǎn)錄啟動子和增強子

慢病毒載體能兼容若干啟動子，諸如管家基因啟動子、細胞特異性啟動子等，由此確保載入的目的基因可以穩(wěn)定表達于特定組織細胞內(nèi)，從而提高轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)錄靶向性。

2.4轉(zhuǎn)移基因片段容量大

慢病毒在改建后，能夠攜帶10 kb左右的外源基因，故大部分cDNA均可以被慢病毒載體攜帶，，只有小分子不能，諸如外源shRNAs等。而值得一提的是，慢病毒病毒滴度一般會隨著目的基因的增長而降低。

3慢病毒載體表達系統(tǒng)的演變

慢病毒載體在早期由HIV改裝而來，包括兩類載體系統(tǒng)：HIV-1型、HIV-2型。其后，在研究不斷深入下，大量種類各異的慢病毒載體系統(tǒng)被慢慢開發(fā)出來，如猿類免疫缺陷病毒（SIV）載體系統(tǒng)、牛免疫缺陷病毒（BIV）載體系統(tǒng)、馬傳染性貧血病毒（EIAV）載體系統(tǒng)等。在基因轉(zhuǎn)染方面，各物種細胞內(nèi)相對應的物種載體系統(tǒng)可能有效性更佳，但是，各物種種類的細胞間能不能交叉應用慢病毒載體，還需要依據(jù)更多、更深入的試驗進行論證和評估。此外，從病毒滴度以及生物安全性等角度分析，慢病毒載體應用也存在一定的局限性。

在設計慢病毒載體的結(jié)構(gòu)時，應遵循以下基本原則：使載體靶向性更強、使轉(zhuǎn)基因表達效率更高、使生物安全性有所保障等。當進行HIV-1載體構(gòu)建時，為了防止有復制能力的病毒（RCV）形成，通常先把HIV-1基因組分裝至多個質(zhì)粒內(nèi)，這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞后即獲得只有一次感染能力而無復制能力的HIV-1載體顆粒。故而，基于質(zhì)粒的個數(shù)，可把慢病毒載體表達系統(tǒng)發(fā)展史分成下述3個過程：

3.1二質(zhì)粒表達系統(tǒng)

此系統(tǒng)構(gòu)成部分有兩個：包裝成分、載體成分。設計該系統(tǒng)時，一是分離存在于HIV-1基因組的編碼反式作用因子以及順式作用元件（含包裝成分），二是對病毒自身的包裝成分與LTR進行全部或部分的保留，同時將編碼反式作用因子序列盡量去除掉，由外源基因代替。故而，此類缺陷型重組病毒復制必需要有其他病毒輔助，這些輔助病毒自身無法增殖。由此類表達系統(tǒng)內(nèi)的二質(zhì)粒對細胞進行共同轉(zhuǎn)染，即可以形成無復制能力且具感染功能的載體顆粒。不過，在轉(zhuǎn)染的過程中二質(zhì)粒表達系統(tǒng)中的載體成分與包裝成分的病毒DNA可能會發(fā)生簡單的重組，這種重組將存在產(chǎn)生具有復制能力的HIV-1病毒的安全隱患。

3.2三質(zhì)粒表達系統(tǒng)

此系統(tǒng)含轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、異源包膜質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒。為了更為有效地防止感染性病毒形成，針對包裝質(zhì)粒，由CMV（巨細胞病毒）啟動子來替換5'LTR，由人B-珠蛋白poly-A信號序列來替換3'LTR。包裝質(zhì)粒不產(chǎn)生輔助蛋白VPU與病毒包膜蛋白，然而可表達復制所需的全部反式激活蛋白。此外，針對包膜質(zhì)粒，由VSV（水皰性口炎病毒）糖蛋白G替換HIV-1自身的包膜蛋白，由此產(chǎn)生異源包膜蛋白質(zhì)粒，由于VSV的G受體大量分布在若干類細胞表面，由此增強了慢病毒載體的宿主細胞傾向性。更換包膜能夠更為有效地抑制HIV-1載體發(fā)展為野生毒，還使得病毒載體滴度提高與穩(wěn)定性增強，同時實現(xiàn)了病毒濃縮技術(shù)的簡單化。

3.3四質(zhì)粒表達系統(tǒng)

在過去的幾年內(nèi)，此系統(tǒng)慢慢發(fā)展起來，由此更為有效地增強了慢病毒載體表達系統(tǒng)的安全性，同時對感染效率不產(chǎn)生影響。此系統(tǒng)所含的四個質(zhì)粒及其功能如下：第一個質(zhì)粒發(fā)揮組裝功能，編碼形成病毒顆粒所必需的蛋白，全部pol以及gag序列包括在此質(zhì)粒內(nèi)，且去掉了4個輔助基因。第二個質(zhì)粒含具整合、逆轉(zhuǎn)錄以及組裝功能的反式作用序列因子，此質(zhì)粒為病毒載體最為關(guān)鍵的部分，包括RRE、LTR。第三個質(zhì)粒負責編碼翻譯合成VSV的糖蛋白G。第四個質(zhì)粒含曾經(jīng)包含在組裝質(zhì)粒內(nèi)rev序列。在慢病毒的制備中，把四個質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染到細胞中，使其大量增殖，最終獲得大量表達質(zhì)粒。

4問題與展望

隨著研究的逐步深入，慢病毒載體表達系統(tǒng)正在被不斷改進，改進的目標主要在于如何使載體顆粒具有更為廣泛的感染能力并喪失復制能力。對于三質(zhì)粒和四質(zhì)粒表達系統(tǒng)而言，其中的包裝信號被刪除，由此導致包裝序列無法整合至病毒基因組內(nèi)，病毒感染宿主細胞后不能復制，更不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒，故而，現(xiàn)今應用率更高。然而，因為人類是HIV-1慢病毒載體的主要宿主，在生物學領(lǐng)域應用慢病毒載體表達系統(tǒng)依然存在潛在風險。未來在設計與改良慢病毒載體表達系統(tǒng)方面，針對包裝質(zhì)粒，可嘗試繼續(xù)縮短其病毒編碼序列長度，由此使病毒基因重組的可能性降低。此外，還需要進一步探索如何促使病毒滴度提高，使慢病毒載體表達系統(tǒng)在各領(lǐng)域的研究中應用更為便捷與廣泛。endprint