淫羊藿苷對(duì)成骨細(xì)胞中β—catenin、ALP和RUNX2表達(dá)的影響

周先進(jìn)+張延芳

[摘要] 骨質(zhì)疏松是由成骨細(xì)胞引導(dǎo)的骨形成小于破骨細(xì)胞引導(dǎo)的骨吸收導(dǎo)致的骨量丟失而引發(fā)的。按照中醫(yī)理論，中藥淫羊藿能夠治療骨質(zhì)疏松，有研究表明其特征成分淫羊藿苷能促進(jìn)骨形成，改善堿性磷酸酶（ALP）活性，調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白、ALP和特異性轉(zhuǎn)錄因子2表達(dá)，但對(duì)成骨細(xì)胞的增殖與分化的影響并不一致。因此，淫羊藿苷應(yīng)用于臨床治療骨質(zhì)疏松有較好的前景，但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

[關(guān)鍵詞] 淫羊藿苷；β-連環(huán)蛋白；堿性磷酸酶；特異性轉(zhuǎn)錄因子2

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）12（c）-0057-04

[Abstract] Osteopenia is caused by the loss of bone mass when bone formation guided by osteoblasts is less than the bone absorption induced by osteoclasts. According to the traditional Chinese medicine， herba epimedii can treat osteoporosis. Besides， studies have shown that Icariin， the characteristic component of herba epimedii can promote bone formation， improve the alkaline phosphatase （ALP） activity， and also up-regulate the expression of key factor beta-catenin， ALP and runt-related transcription factor 2 of osteoblast. However， Icariin has different effects on the proliferation and differentiation of osteoblasts. Therefore， Icariin has an attractive prospect in clinical treatment of osteoporosis， but its mechanism needs further study.

[Key words] Icariin； β-catenin； Alkaline phosphatase； Runt-related transcription factor 2

骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和易于骨折的全身性骨代謝性疾病，好發(fā)于老人及絕經(jīng)后婦女。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球患者可達(dá)到2億例，其發(fā)病率已經(jīng)躍居世界各種常見病的第7位，嚴(yán)重威脅著人類的身心健康。OP的防治已經(jīng)成為世界性課題。目前現(xiàn)有的治療OP藥物存在過敏、食管刺激和價(jià)格昂貴等缺陷[1]。而中藥在這些方面問題較少，具有價(jià)廉易得，副作用小特點(diǎn)。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，OP屬于骨痹范疇。中藥淫羊藿，具有潛在的促進(jìn)骨愈合的作用，可促進(jìn)成骨細(xì)胞（osteoblasts，OB）活性，抑制破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）分化，具有良好的骨誘導(dǎo)性；其發(fā)揮藥效的主要成分為黃酮苷類，淫羊藿苷（Icariin，ICA）是其中主要的黃酮苷[2]。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）和OB的特異性轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）是OB增殖分化的重要指標(biāo)，本文通過探討ICA對(duì)OB中β-catenin、ALP和RUNX2表達(dá)的影響，為中藥防治OP提供依據(jù)。

1 淫羊藿的衍生物家族

ICA是淫羊藿中的特征成分，能夠促進(jìn)OP動(dòng)物模型中新骨的形成和骨量的增加。ICA體外水解得到淫羊藿次苷Ⅱ，繼續(xù)水解得到淫羊藿素，二者都具有與ICA類似的藥理學(xué)活性[3]。ICA在體外能夠促進(jìn)OB增殖、分化和礦化，從而加快骨形成作用，同時(shí)能抑制OC增殖，降低OC吸收功能。

2 ICA對(duì)OB的作用機(jī)制

當(dāng)前大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ICA能夠促進(jìn)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化，增強(qiáng)OB中基質(zhì)的礦化，具有良好的成骨誘導(dǎo)性[4]。其增強(qiáng)OB活性的同時(shí)，還可以抑制OC的分化和骨吸收功能，有較強(qiáng)的促骨形成活性，其雙重作用能夠大大加快骨組織的愈合[5]。

2.1 OB增殖分化的關(guān)鍵因子

OB是骨發(fā)生和骨形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是骨質(zhì)更新過程中是最重要的功能細(xì)胞[6]。在OB增殖分化過程中，細(xì)胞因子起著關(guān)鍵作用。Wnt經(jīng)典信號(hào)通路與OB增殖密切相關(guān)，而β-catenin是其通路中最關(guān)鍵的因子之一，能反映OB的增殖[7]。ALP是OB早起分化標(biāo)志物，在OB增殖期能夠高表達(dá)[8]。RUNX2是OB分化必要的特異性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)骨組織的形成和重建起著重要作用。

2.2 ICA對(duì)OB中β-catenin表達(dá)的影響

β-catenin是Wnt經(jīng)典信號(hào)通路中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其量的積累是Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)Wnt經(jīng)典信號(hào)通路啟動(dòng)時(shí)，切斷β-catenin的降解途徑，β-catenin在胞內(nèi)聚集，入核替換轉(zhuǎn)錄抑制因子與T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合因子結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄所需的輔助激活因子，解除抑制，特異激活Wnt下游的靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的分化增殖。

近幾年來，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路確實(shí)參與了骨形成的過程，ICA能促進(jìn)Wnt經(jīng)典通路中關(guān)鍵因子β-catenin表達(dá)上調(diào)，激活下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)OB的增殖分化。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)ICA能上調(diào)成骨基因RUNX2表達(dá)，抑制OC的活性，增加缺損區(qū)骨量，通過經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑，有效地促進(jìn)骨愈合。不同濃度的ICA能促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)，使得β-catenin在胞內(nèi)聚集，入核激活Wnt經(jīng)典通路，刺激Wnt下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)OB的增殖分化[9]。在體外實(shí)驗(yàn)研究中，用含1 μg/mL ICA的培養(yǎng)液培養(yǎng)OB，β-catenin基因表達(dá)上調(diào)，而加入Wnt/β-catenin抑制劑即DKK1后，β-catenin基因的表達(dá)降低，說明Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能參與了ICA促進(jìn)OB增殖分化的過程[10]。用不同濃度的ICA干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞，與ICA和Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑（Noggin、DKK-1）聯(lián)合使用干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞相比，ICA通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin的表達(dá)，促進(jìn)MC3T3-E1前OB的成骨分化[11]。最新研究也證實(shí)，Wnt經(jīng)典通路參與了OB的增殖分化，ICA還能促進(jìn)前OB分化為OB，并且其與知母皂苷或阿魏酸等配伍使用效果更佳。單獨(dú)用ICA，知母皂苷或阿魏酸及其組合作用于去雙側(cè)卵巢的OP模型，以及培養(yǎng)原代OB，均發(fā)現(xiàn)三者組合增強(qiáng)了治療效果，而不增加對(duì)OP小鼠的不良影響，協(xié)同增加OB增殖，ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成，并通過調(diào)節(jié)OB中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)骨基質(zhì)的表達(dá)[12]。也有報(bào)道ICA可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞（MSC）的成骨分化，并通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)鈦顆粒誘導(dǎo)的溶骨部位的新骨形成[13]或ICA通過激活ERα-Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)大鼠MSC的成骨分化[14]。endprint

上述研究均顯示，ICA能通過激活Wnt經(jīng)典通路，使β-catenin在胞內(nèi)聚集入核，促進(jìn)OB的增殖分化。

2.3 ICA對(duì)OB中ALP表達(dá)的影響

ALP是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經(jīng)肝臟向外排出的一種酶。ALP不是單一的酶，而是一組同功酶。ALP活性是OB功能及分化程度的指標(biāo)，是OB早期分化的標(biāo)志物。ALP在細(xì)胞中表達(dá)的多少，反映OB的活性，OB處于增殖期時(shí)，ALP高表達(dá)。

ICA能使ALP高表達(dá)，提高其活性，促進(jìn)OB增殖分化，抑制骨吸收。ICA可以顯著促進(jìn)鈦顆粒作用下的OB增殖，最佳藥物濃度為10-9 mol/L，并且在此濃度下的ICA可以顯著增加OB中的ALP活性和鈣化結(jié)節(jié)形成[15]。ICA能顯著上調(diào)ALP的表達(dá)，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，增強(qiáng)ALP活性，提高OB的活力[16]。

此外，也有研究表明ICA對(duì)OB的增殖分化沒有顯著影響，甚至以劑量依賴性方式抑制OB增殖，但是ALP活性顯著增強(qiáng)，ICA以劑量依賴性方式抑制OB增殖，最終濃度為1×10-5 mol/L的ICA可顯著增強(qiáng)OB的成骨分化和成熟，表明ICA具有誘導(dǎo)骨形成的活性[17]。不同濃度的ICA培養(yǎng)大鼠的OB，在1×10-5 mol/L的濃度下，對(duì)OB的增殖沒有顯著影響，但ALP活性顯著增強(qiáng)[18]。ICA對(duì)OB的增殖沒有影響，但改善了ALP活性[19]。ICA增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化，但對(duì)新生大鼠的顱骨OB的分化沒有影響[20]。

以上研究表明，ICA對(duì)OB增殖分化的作用結(jié)論尚不一致，但均能增強(qiáng)ALP的活性。

2.4 ICA對(duì)OB中RUNX2表達(dá)的影響

Runx蛋白是一類轉(zhuǎn)錄因子蛋白的統(tǒng)稱，其中RU？鄄NX2是OB分化必須的特異轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)骨組織的形成和重建起著重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)適宜劑量的ICA能促進(jìn)OB的增殖分化，同時(shí)能使RUNX2的表達(dá)上調(diào)[21]。最適濃度的ICA對(duì)OB分化和礦化比最佳濃度的地塞米松更有效，RUNX2基因表達(dá)水平也更高，濃度在10-5 mol/L時(shí)，ICA能使RUNX2基因表達(dá)水平更高，更好地促進(jìn)OB分化和礦化[22]。在體外存在或不存在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件下，用ICA作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，ICA均能促進(jìn)RUNX2的表達(dá)，有利于骨形成作用[23]。

近兩年的研究也表明，RUNX2的表達(dá)上調(diào)與OB的增殖分化有較大關(guān)聯(lián)。ICA同樣可以通過上調(diào)RUNX2 mRNA表達(dá)水平來促進(jìn)BMSCs向OB的分化[24]，ICA最佳誘導(dǎo)濃度為1×10-6 mol/L，與對(duì)照組相比，此濃度下ICA能顯著增加RUNX2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)[25]，用不同濃度的ICA干預(yù)培養(yǎng)不同時(shí)間，ICA對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠OB增殖并無顯著影響，但可明顯促進(jìn)OB的分化、上調(diào)RUNX2蛋白的表達(dá)，并且高濃度ICA抑制OB生長(zhǎng)[26]。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ICA能促進(jìn)OB的分化，對(duì)于其增殖的影響尚有異議，且能上調(diào)成骨分化相關(guān)基因RUNX2的表達(dá)。

3 展望

ICA能促進(jìn)OB成骨，抑制OC分化與骨吸收，還能促進(jìn)MSC成骨定向分化，增強(qiáng)機(jī)制礦化功能，且相較于其他治療骨質(zhì)疏松的藥物，ICA具有毒副作用小，來源廣泛，提取工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，易于儲(chǔ)存的優(yōu)勢(shì)，這些特性有助于其相關(guān)新藥的開發(fā)。并且ICA還能增加心腦血管血流量、促進(jìn)造血功能、免疫功能，具有抗衰老、抗腫瘤等功效，治療骨質(zhì)疏松的同時(shí)，可以起到防治其他疾病的作用。

目前，研究均發(fā)現(xiàn)ICA能上調(diào)β-catenin和RUN？鄄X2的表達(dá)，改善ALP活性。ICA對(duì)OB增殖分化的影響結(jié)論尚不一致，ICA對(duì)OB增殖分化沒有影響，甚至以劑量依賴性抑制OB的增殖，對(duì)骨形成以及骨吸收的作用機(jī)制也尚不明確，但也有研究表明ICA能促進(jìn)骨形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)論不一致，有可能是ICA濃度不同，誘導(dǎo)時(shí)間不一樣，或者作用的對(duì)象不同，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有較大的偏差。因此，還需要進(jìn)行大量更深入的研究，探討ICA對(duì)OB增殖分化是否有效，達(dá)到何劑量起效，最適劑量又是多少，以及ICA成骨的分子機(jī)制，為開發(fā)ICA相關(guān)藥物提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-03-23 本文編輯：李岳澤）endprint